妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus， GDM)是指妊娠期间发现糖代谢不同程度的异常，但除外妊娠前已患有糖尿病的孕妇，GDM孕妇易发生各种并发症和合并症，如羊水过多、巨大儿、胎儿畸形、泌尿系感染、妊娠期高血压疾病等疾病。随着近年来生活水平的提高，巨大儿的发生率逐年上升，其对母婴的结局有重要的影响，如分娩时产伤增加、远期后遗症、围产儿的死亡率增加等。因此，探究糖尿病及巨大儿的发生机制十分重要。有关碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)与妊娠期糖尿病巨大儿的关系研究起步较晚。bFGF是FGFs家族中的FGF2，因其等电点为9.6，故其称为bFGF。bFGF是具有高度保守性的碱性多肽类生长因子，其主要来源于内胚层、中胚层及外胚层细胞，具有促血管生成和促有丝分裂的作用[1]。bFGF是一种体内发现的最有效的血管源性生长因子之一，可以调节胎盘血管的形成和舒张，并可促进缺血组织的血管生成[3]。同时，bFGF参与正常胎盘血管的生成和滋养细胞生成，促进子宫螺旋动脉形成和滋养细胞侵入子宫内膜，以维持其功能。刺激滋养细胞增殖和分化[4]。本研究采用荧光定量PCR方法检测妊娠足月胎盘bFGF的水平，探讨bFGF对妊娠期糖尿病及巨大儿发生的影响。
对象与方法
一、对象
收集2014年6月—2015年12月在本院产科门诊规律产检及住院生产，仅患有妊娠期糖尿病和无任何妊娠合并症及并发症的患者24例，妊娠期糖尿病的诊断标准[2]：妊娠期糖尿病的诊断标准为妊娠前无糖尿病的孕妇，在妊娠24～28周时行75 g OGTT试验，分别以空腹及服糖后1、2 h血糖值为5.1 mmol/L，10.0 mmol/L，8.5 mmol/L为标准，有其中一个值高于标准值即诊断为妊娠期糖尿病。GDM病例均为单胎初产，年龄18～34岁，足月孕周在37～41+6周，孕前体重指数≤23.9 kg/m2。其中生产巨大儿(新生儿体重≥4 000 g)12例(GDM巨大儿组)，正常体重儿(2 500 g≤新生儿体重<4 000 g)12例(GDM正常儿组)。收集同期在本院产科门诊规律产检及住院生产的正常产妇24例，其中生产巨大儿12例(巨大儿组)，正常体重儿12例(正常儿组)。两组年龄、孕周和孕前体重指数比较，差异无统计学意义，见表1。
表1 四组一般资料比较
二、方法
1.bFGF水平测定：采用实时荧光定量PCR方法检测胎盘组织内bFGF含量。(1)组织总RNA提取。将收集的胎盘组织用Trizol试剂(博日(BioFlux)公司)提取总RNA,操作严格按照说明书进行，提取的RNA用1.5%琼脂糖凝胶鉴定，用紫外分光光度计(美国BIO-RAO公司，SmartSpecTM 3000)测定RNA含量，总RNA纯度，以OD260/OD280在1.8～2.1视为合格。(2)逆转录定量PCR。将逆转录合成cDNA进行序列设计引物扩增。bFGF上游引物：5’-GCCTTCTCTTTCAGCATTCA-3’，下游5’-AGCCAACTCGTAACAATCCA-3’，扩增条带大小为160 bp。GAPDH：5’-TCCTGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’，扩增条带大小为125 bp。引物由上海生物工程技术服务公司合成，同时设置RNase-free water作为模板反应体系的阴性对照，排除基因DNA的污染。引物用DEPC水稀释为最终浓度为10 mmol/L。PCR反应体系共20 μl：逆转录合成的cDNA模板2 μl，Taq PCR Master Mix 10 μl，去离子水7 μl，以及上下游引物各0.5 μl，应用荧光定量PCR仪(BIO-RAO公司)进行PCR反应，目的基因与GAPDH同批扩增，各样本各做2个复孔，取均值。反应条件为95 ℃反应30 min，1次；95 ℃反应30 s；56 ℃反应30 s；72 ℃反应30 s，此过程循环35次；72 ℃延伸7 min终末延伸。扩增完毕后，进行溶解曲线分析，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，0.1 ℃/s升温到92 ℃，连续荧光测定，将实时荧光定量PCR所得数据用2-△△C法进行处理，Ct值为循环数，△△Ct =(Ct目的基因-Ct内参基因)-(Ct阴性对照-Ct内参基因)，计算2-△△C得出bFGF相对表达量。
2.统计学处理：采用SPSS 17.0软件学软件，计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
以正常儿组为阴性对照，GDM正常儿组和正常儿组的bFGF相对表达量为(4.47±3.73)和(1.64±1.20)，GDM正常儿组bFGF的表达量升高；以巨大儿组为阴性对照，GDM巨大儿组和巨大儿组bFGF相对表达量为(1.73±1.61)和(1.11±0.64)，GDM巨大儿组bFGF表达量升高；以GDM正常儿组为阴性对照，GDM正常儿组和GDM巨大儿组bFGF相对表达量为(1.36±1.14)和(1.23±1.23)，GDM巨大儿组bFGF表达量降低；以正常儿组为阴性对照，正常儿组和巨大儿组bFGF表达量为(1.64±1.20)和(1.53±1.60)，巨大儿bFGF表达量降低；差异均有统计学意义。
将正常儿组和GDM正常儿组合并为总体正常儿组，巨大儿组和GDM巨大儿组合并为总体巨大儿组。以总体正常儿组为阴性对照，总体正常儿组和合并巨大儿组bFGF相对表达量为(1.68±1.67)和(1.51±1.71)，合并巨大儿组bFGF相对表达量降低，差异有统计学意义。
讨 论
妊娠期糖尿病和巨大儿的发生被认为是由于多种因素相互作用的结果，其发生机制较复杂。近年来，人们对其发病机制进行了广泛研究，但关于bFGF与妊娠期糖尿病及新生儿体重关系的研究较晚。1995年Hill等[5]首次报道了通过测量妊娠中晚期妊娠期糖尿病孕妇母血、脐静脉血及羊水中bFGF的含量发现妊娠期糖尿病孕妇母血、脐静脉血、羊水中的bFGF含量均比正常孕妇明显升高，并认为bFGF可促进胚胎形成及胎儿发育，发现胎盘bFGFmRNA主要存在于合体滋养层细胞，并将bFGF直接分泌到母血、脐静脉血中。Lygnos等[6]通过对不同孕期孕妇研究表明，bFGF在整个孕期表达的水平较未孕时是增加的，且在孕早期增加的程度更明显，在孕中、晚期逐渐减弱，并猜测其与胎盘血管形成的阶段相关联，但未行进一步的实验。张建鸿等[7]对妊娠中、晚期孕妇血清bFGF与妊娠糖尿病性巨大儿的关系进行研究，糖代谢异常组孕妇血清bFGF水平明显高于正常组，且孕妇血清bFGF与新生儿体重呈正相关，糖代谢异常孕妇血清bFGF表达结果与Hill等[5]报告相符。本研究通过对新生儿体重进行分组，再次验证了妊娠期糖尿病孕妇胎盘中bFGF表达增加，发现当新生儿为巨大儿时，胎盘中bFGF表达降低。Burleigh等[8]通过对妊娠期糖尿病及非妊娠期糖尿病患者胎盘中bFGF的表达研究，发现在妊娠期糖尿病孕妇胎盘组织中bFGF表达增加，而在胎盘细胞间质中bFGF的含量降低，并推测可能与其自身的代偿机制有关；同时研究发现，bFGF在胎盘中有抗细胞凋亡的作用。推测妊娠期糖尿病bFGF的表达增加可能与胎盘组织的缺血缺氧有关，bFGF为胎盘组织主要的血管源性生长因子之一，在缺血组织中可促进血管生成，从而使胎盘适应高糖环境。
目前国内外对于bFGF与巨大儿的关系研究甚少。本研究通过对妊娠期糖尿病和巨大儿分别进行研究发现，当孕妇为妊娠期糖尿病，新生儿为巨大儿时胎盘中bFGF的表达降低，当孕妇为非妊娠期糖尿病时，巨大儿胎盘bFGF的表达仍降低；当不考虑孕妇是否为糖尿病时，巨大儿和正常体重儿进行比较发现巨大儿胎盘中bFGF表达也降低。推测通过测量bFGF值可以预测胎儿的大小，从而可以指导孕妇，以防胎儿过度生长，避免巨大儿的发生。孙长学等[9]曾研究发现巨大儿胎盘绒毛血管数、血管绒毛横面积比及绒毛面密度分别与正常对照组比较，无差异，表明妊娠末期巨大儿胎盘中的血液供应无变化，推测巨大儿组胎盘中bFGF表达减低可能主要与胎盘氧浓度及营养物质的转运有关。由于巨大儿胎盘绒毛间氧气及营养物质的转运能力明显提高，导致巨大儿组胎盘绒毛间的氧分压高于正常体重儿组，从而导致妊娠末期巨大儿组胎盘中bFGF的表达降低，猜测可能是一种负反馈调节机制的作用。但这种差异是妊娠期的何时产生的，仍需进一步探索。
参考文献
1 Granato AM,Nanni O,Falcini F,et al.Basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor serum levels in breast cancer patients and healthy women:useful as diagnostic tools?Breast Cancer Res,2004,6:R38-R45.
2 中华医学会妇产科学分会产科学组,中华医学会围产医学分会妊娠合并糖尿病协作组.妊娠合并糖尿病诊治指南(2014).中华围产医学杂志2014,17：537-545.
3 Gravdal K,Halvorsen OJ,Haukaas SA,et al.Expression of bFGF/FGFR-1 and vascular proliferstion related to clinicopathologic features and tumor progress in localized prostate cance.Virchows Arch,2006,448:68-74.
4 Stepanova OI,Safronova NU,Furaeva KN,et al.Effects of Placental Secretory Factors on Cytokine Production by Endothelial Cells.Bulletin of Experimental Biology and Medicine.Bull Exp Biol Med，2013,154:375-378.
5 Hill DJ.Fibroblast growth factor 2 is elebated in term maternal and cord serum and amniotic fluid in pregnancies complicated by diabetes:relationship to fetai and placental size.J Clin Endocrinol Metab,1995,80:2626-2632.
6 Lygnos MC,Pappa KI,Papadaki HA,et al.Changes in maternal plasma levels of VEGF,bFGF,TGF-beta1,ET-1 and sKL during uncomplicated pregnancy,hypertensive pregnancy and gestational diabetes.In Vivo,2006,20:157-163.
7 张建鸿,谢雪玲,黄绍坤,等.妊娠期糖代谢异常性巨大儿与成纤维细胞生长因子的关系.中国优生与遗传杂志，2006,14：70-71.
8 Burleigh DW,Stewart K,Grindle KM,et al.Influence of maternal diabetes on placental fibroblast growth factor-2 expression,proliferation,and apoptosis.Soc Gynecol Investig ,2004,11:36-41.
9 孙长学，李贵瑜.宫内发育迟缓胎儿和巨大儿胎盘表皮生长因子受体表达的变化及与胎盘绒毛病理的关系.中国妇幼保健，2000,15:42-44.