子宫内膜癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一。近年来，其发病率逐年上升，已趋于接近甚至超过宫颈癌，严重威胁着女性的健康，成为研究的重点之一。子宫内膜癌的发生是一个渐进的复杂过程，一般认为子宫内膜受长期持续的雌激素刺激，而又无孕激素拮抗，导致子宫内膜增生，进而发生癌变而形成子宫内膜癌。其中可能有许多癌基因、抑癌基因、错配修复基因及细胞因子等参与。虽然国内外许多妇科肿瘤学家已经对子宫内膜癌进行了大量的研究，但子宫内膜癌发生、发展的分子机制及病理生理学机制仍不明确。因此，有必要进一步探索子宫内膜癌发生发展的机制，从而达到早期诊断、及时治疗、降低死亡率、延缓生命、提高生活质量的目的。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是近年来发现的一种磷酸化糖蛋白，与恶性肿瘤的发生发展及转移有着密切的关系。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是基质金属蛋白酶家族中的一员，是一种糖蛋白，是细胞外基质降解的主要介质。近年来的研究表明，MMP-9在肿瘤侵袭转移过程中也起着重要的作用[1]，但有关OPN和MMP-9在子宫内膜癌中的相关性研究尚少见报道。本研究通过检测OPN和MMP-9在子宫内膜癌和正常增生期子宫内膜组织中的表达，以及二者在人子宫内膜癌中表达的相关性，以期对临床工作有一定的指导意义。
对象与方法
1.对象：2012年1月—2014年12月深圳市妇幼保健院医院手术切除的组织标本63例，所有患者术前均未做化疗、放疗及激素治疗，术后常规病理确诊。年龄为36～73岁，平均(55.9±9.3)岁。子宫内膜癌45例，组织类型均为子宫内膜样腺癌，根据国际妇产科联盟(FIGO)分类法进行分期。正常增生期子宫内膜组织18例。病理诊断经两位病理专家确证。组织标本10%甲醛固定，石蜡包埋，制备成4 μm厚切片。
2.免疫组织化学检查：采用S-P两步法。兔抗人OPN多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物科技公司，工作浓度1∶200。兔抗人MMP-9多克隆抗体及即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒购自福州迈新生物科技公司。整个过程按试剂盒说明书进行。每批染色均设已知阳性切片(肝癌)做阳性对照，用磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照。
3.结果判定：每张切片于400倍光镜下随机选取4个视野，采用Metamorph/DP10/BX41显微图像分析系统，对其中一个具有代表意义的阳性结果视野的棕黄色颗粒进行标记，以此标准自动检测所有视野的阳性结果，以参数积分光密度(integral optical density，IOD)代表蛋白颗粒密度。
4.统计学处理：采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以
表示，组间差异采用单因素方差分析和独立样本Dunnett t检验；相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.OPN和MMP-9的表达：OPN和MMP-9主要在细胞的胞浆中表达，呈棕黄色(图1)，在子宫内膜癌中表达水平明显高于在正常增生期子宫内膜组织中的表达(表1)。OPN和MMP-9与肌层浸润和手术病理分期有关，与组织病理学分级、淋巴结转移无关(表1)。
图1 病理图(SP免疫组化，×400) A.OPN在子宫内膜癌中的表达；B.MMP-9在子宫内膜癌中的表达
表1 OPN和MMP-9在正常卵巢组织及上皮性卵巢肿瘤中的表达
注：肌层浸润内比较,P<0.05；病理分期内比较,P<0.05
2.OPN和MMP-9在子宫内膜癌中表达的相关分析：OPN和MMP-9在子宫内膜癌中均呈高表达，二者正相关(r=0.30，P<0.05，图2)。
图2 OPN与MMP9在子宫内膜癌中表达的相关性
讨论
OPN是SIBLING家族中的一员，是细胞外基质中一重要的功能性蛋白。人类OPN基因定位于4q13，是一独立编码基因，由7个外显子和6个内含子组成。起初认为OPN参与骨的吸收，与骨组织的矿化有关。现发现OPN的RGD序列与许多细胞外基质蛋白的黏附序列相同，在人体组织中分布广泛，且具有多种功能。特别是近年研究发现，OPN与肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移密切相关[2]。近年Zhang等[3]应用基因表达图谱技术来筛选新的肿瘤标记物，OPN被确定为临床上领头基因。有研究报道[4-5]OPN表达强弱与乳腺癌恶性程度相关，Prager等[6]以血清OPN和CA125水平来评估直肠癌患者预后价值。Wilson等[7]对一组包括头颈、食管、乳腺、肺、肝、胃肠、膀胱、子宫等全身实体肿瘤组织大宗病例OPN表达研究比较发现，OPN蛋白表达普遍增高。
MMP-9是一类依赖锌离子的蛋白水解酶，其主要作用是降解基底膜和细胞外基质胶原蛋白，使肿瘤细胞易于突破基底膜和细胞外基质，向邻近器官浸润，并侵入淋巴管及小血管向远处转移，它能够促进微血管的生成，为肿瘤的生长、局部侵袭乃至远处转移创造了有利的条件。MMP-9基因定位于染色体20q11.2-q13.1，有13个外显子，编码92 kD蛋白，具有强大的基质降解活性和广泛的底物活性，在各种癌组织中呈过度表达，其中包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、肺癌等[7]。
最近的研究表明，外基质中大部分基质蛋白分子尤其是非胶原蛋白分子(如纤维连接蛋白、层黏连蛋白、OPN等)均具备一些具有生物活性的结构域，Davis等将其称之为基质潜在位点[8]。同时Philip等[9]报道，OPN通过激活相关信号转导通路，使pro-MMP-9活化为MMP-9，促进细胞移行、细胞外基质降解及肿瘤生长。Rangaswami等[10]报道OPN分子中有部MMP的酶切位点。经MMP酶切后的OPN与细胞表面的整合素结合后可以促进细胞的黏附与迁移。OPN可以通过IkBa/IKK信号途径激活MMP-9表述，加快肿瘤细胞周围的IV型胶原等细胞外基质的降解，为肿瘤细胞的组织浸润及转移提供有利条件。本研究结果表明，OPN和MMP-9在子宫内膜癌中的表达呈正相关，OPN的表达有助于癌细胞在周围基质中黏附和迁移功能的发挥，MMP-9则有助于癌细胞突破周围致密的结缔组织，为肿瘤的转移铺平了道路。
总之，OPN和MMP-9之间的相互作用，进一步加快了肿瘤细胞转移的进程。因此，联合检测OPN和MMP-9可能成为子宫内膜癌诊断性标志物及有效的治疗靶点，对子宫内膜癌的早期诊断及改善子宫内膜癌患者的预后具有重要的指导和治疗意义。
参考文献
1 Douglas B.Invasion and metastasis.Cancer and Metastasis Rev,2000,15:77-81.
2 Hunter C,Bond J,Kuo PC,et al.The role of osteopontin and osteopontin aptamer (OPN-R3) in fibroblast activity.J Surg Res,2012,176:348-358.
3 Zhang Y,Zhao J,Zhang Q.The expression and clinical significance of OPN and C-met in laryngeal carcinoma.Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi,2014,28:256-258.
4 Jin Y,Chen JN,Feng ZY,et al.OPN expression are predictors of disease severity and worse prognosis in hepatocellular carcinoma.PloS One,2014,9:87-93.
5 Hao Y,Liu J,Wang P,et al.OPN Polymorphism Is Related to the Chemotherapy Res ponse and Prognosis in Advanced NSCLC.Int J Genomics,2014,201:142-146.
6 Prager AJ,Peng CR,Lita E,et al.Urinary aHGF,CA125 and OPN as diagnostic and prognostic biomarkers for prostate cancer.Biomark Med,2013,7:831-841.
7 Wilson CL,Matrisian LM.Matrilysin an epithelial matris metalproteinase with potential lynovel functions.Int J Biochem Cell Biol,2013,28:123-136.
8 Davis GE,Bayless kj,Davi MJ,et al.Regulation of tissue injury by the exposure ofm atricryp tic sites within extracellular matrixmolecules.Am J Pathol,2000,156:1489-1498.
9 Philip S,Kundu GC.Osteopontin induces nuclear factor kappa B-mediated promatrix metallo-proteinase-2 activation through I kappa B alpha/IKK signaling pathways,and curcumin (difer-ulolylmethane) down-regulates these pathways.Biol Chem,2013,278:14487-14497.
10 Rangaswami H,Bulbule A.Nuelear fartor inducing kinaseplays crucial role in osteopon tin induced MAPK/IKK dependent nuclear factor kB-mediated promatrix metalloproteinase-9 activation.Biol Chem,2004,297:38921-38935.