颞叶癫痫是较常见的难治性癫痫。研究表明，海马是与颞叶癫痫的形成密切相关的脑区，且有很多研究证实，成年海马具有神经发生能力[1]。癫痫发作引起的海马神经发生，可能与癫痫易感性及癫痫形成有关，但其分子调控机制尚不明确。
Wnts是一组分泌性糖蛋白，对生物体的多个方面都有调控作用，对细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡也至关重要[2]。目前大量研究证实，Wnt信号分子参与海马神经发生的调控，阻断Wnt信号通路可以消除齿状回海马神经发生[3]。目前已明确的三条Wnt信号通路中，Wnt/β-catenin通路是经典的Wnt信号通路[4]。分泌型抑制剂DKK可与LRP 5/6竞争性结合，起到抑制Wnt信号通路的作用[5]。在调控海马神经发生的众多Wnt基因中，Wnt5a能够加强突触信号传递，可以通过活化Wnt信号通路而改善认知功能损害，具有保护认知功能的能力[6]。丙戊酸钠是常用的广谱抗痫药物之一，也可用于偏头痛、双相情感障碍等神经精神疾病。目前研究发现Wnt信号通路功能障碍与双相情感障碍有关，临床治疗剂量的丙戊酸钠可以通过Wnt信号通路发挥治疗作用[7]。此外有研究显示，丙戊酸钠暴露的孤独症模型鼠脑组织Wnt/β-catenin通路活性增加，该信号通路功能增强使其靶基因表达上调[8]。而丙戊酸钠是否会通过Wnt信号通路调控海马神经发生而发挥其抗痫作用尚不十分明确[9]。
KA点燃颞叶癫痫动物模型是目前国际公认的人类颞叶癫痫动物模型，在癫痫的产生、扩散及痫样放电所致的病理损伤等研究领域中发挥着重要作用。该模型癫痫发作形式、海马神经病理损伤及对抗癫痫药物的反应等都与临床癫痫患者相似[10]。本研究小组前期研究结果显示，KA致痫后在颞叶癫痫形成过程中，动物海马组织Wnt5a mRNA的表达呈动态变化，提示Wnt5a可能通过调控大鼠海马神经发生参与KA点燃颞叶癫痫的形成，但其调控海马神经发生的确切机制及它具体通过哪条Wnt信号通路发挥作用尚不清楚。为进一步明确Wnt5a是否通过经典的Wnt/β-catenin信号通路参与颞叶癫痫海马神经发生，将检测Wnt/β-catenin信号通路下游核心分子β-catenin和GSK-3β的时间变化过程，并观察抗癫痫药物丙戊酸钠对上述基因表达的影响，以明确Wnt5a是否通过经典的Wnt/β-catenin信号通路参与颞叶癫痫海马神经发生，VPA的抗痫作用机制与β-catenin和GSK-3β信号分子是否相关。
对象与方法
1.对象：生后30天的雄性SD大鼠(哈尔滨医科大学附属第二医院动物室提供)，体重80～100 g。
2.实验动物分组：按观察处理时间分为KA点燃急性期(1周组)、自发性反复癫痫形成初期(4周组)和慢性癫痫稳定形成期(8周组)。每个时间段分为3组，红藻氨酸(KA)组、红藻氨酸+丙戊酸钠(KA+VPA)组和生理盐水(NS)对照组，每组动物6只。
3.红藻氨酸点燃癫痫模型的制备：生后30天的雄性SD大鼠按12 mg/kg体重皮下注射KA(一次给药)，此剂量足以诱发动物出现癫痫持续状态及自发性再发抽搐[11]。在KA点燃后可出现Racine描述的不同等级的癫痫行为[12]。本研究所有动物均出现Racine描述的Ⅳ以上癫痫行为，说明癫痫模型制备成功。对照组动物皮下注射相同剂量的生理盐水。
4.实验动物处理：各实验组动物处理当日均正常进食水，KA点燃后24 h红藻氨酸+丙戊酸钠(KA+VPA)组动物按200 mg/kg体重每日给予丙戊酸钠(德巴金口服液，杭州赛诺菲安万特民生制药)灌胃一次，每周称量体重一次，调整用药剂量。各组动物分别在相应的观察处理时间结束时，经10%的水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉，断头取脑，快速分离双侧海马，迅速放入液氮中，后转入-80 ℃冰箱备用。
5.Real--time PCR检测β-catenin、GSK-3βmRNA的表达：利用Trizol法提取各组动物海马组织总RNA，采用紫外分光光度计根据260/280比值测RNA浓度和纯度。采用cDNA反转录试剂盒(Rocket Script RT Premix; Bioneer; South Korea)，进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。应用扩增试剂盒进行PCR扩增，以β-actin做内参。扩增程序如下，95℃ 60 s，(95℃ 15 s，60℃ 45 s)×45个循环，4℃ 30 min。引物序列(博仕生物公司)如下，β-catenin上游5'- GTGAAAATGCTTGGGTCGC -3'，下游5'- TGAAGGCAGTCTGTCGTAATAGC -3'；GSK-3β上游5'- CACACCTGCCCTCTTCAAC -3'，下游5'- ACGGTCTCCAGCATTAGTATCT -3'；β-actin上游5'- AAGATCCTGACCGAGCGTGG -3'，下游5'- CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG -3'。采用2-△△CT法对数据进行定量分析。
6.统计学处理：应用SPSS 19.0统计软件。计量资料以均值±标准差表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两样本比较采用t检验。检验水准α=0.05。
结果
1.β-catenin mRNA在颞叶癫痫形成中的时间变化过程：KA致痫后在颞叶癫痫形成过程中，KA组急性期β-catenin mRNA的表达(0.76±0.06)较对照组(1.00±0.00)显著下降，差异有统计学意义；癫痫形成初期的表达(1.00±0.07)与对照组，差异无统计学意义；慢性期的表达(1.33±0.25)与对照组比较显著增高，差异有统计学意义。β-catenin mRNA在癫痫形成初期的表达较急性期增高，慢性期较急性期和癫痫形成初期均显著增高，差异均有统计学意义；见图1。
2.GSK-3βmRNA在颞叶癫痫形成中的时间变化过程：KA组动物海马组织急性期GSK-3βmRNA的表达(0.72±0.12)较对照组(1.00±0.00)显著下降，癫痫形成初期(0.41±0.12)较对照组也降低，差异均有统计学意义；慢性期(0.82±0.10)与对照组比较，差异无统计学意义。癫痫形成初期GSK-3βmRNA的表达较急性期显著下降，慢性期较癫痫形成初期明显增高，差异均有统计学意义，见图2。
3.丙戊酸钠对海马β-catenin和GSK-3β mRNA表达的影响：KA+VPA组大鼠海马组织β-catenin mRNA的表达在颞叶癫痫形成的过程中呈现与KA组相同的变化趋势。KA+VPA组急性期β-catenin mRNA的表达(0.79±0.11)较对照组显著下降，差异有统计学意义；癫痫初期的表达(0.94±0.08)与对照组比较，差异无统计学意义；慢性期表达(1.21±0.27)较对照组增高，差异无统计学意义。KA+VPA组大鼠海马组织GSK-3βmRNA的表达在颞叶癫痫形成的过程中也呈现与KA组相同的变化趋势。KA+VPA组急性期GSK-3β mRNA的表达(0.78±0.20)较对照组显著下降，癫痫初期的表达(0.45±0.07)也降低，差异均有统计学意义；慢性期的表达(0.94±0.28)与对照组比较，差异无统计学意义。KA+VPA组和KA组大鼠海马组织β-catenin和GSK-3β mRNA的表达在KA点燃后颞叶癫痫形成的不同阶段比较，差异均无统计学意义，见图1、图2。
图1 大鼠海马组织β-catenin mRNA在癫痫形成过程中的表达
图2 大鼠海马组织GSK-3β mRNA在癫痫形成过程中的表达
讨论
癫痫是儿科神经系统常见疾病，近年来虽新型抗癫痫药物不断涌现，但仍有25%～30%的癫痫患者转为难治性癫痫。颞叶癫痫是较为常见的难治性癫痫，目前其确切发病机制尚不清楚。海马是与颞叶癫痫形成紧密相关的脑区，而在很多研究中也证实，成年海马具有神经发生能力[1]。海马齿状回颗粒细胞下层的多能祖细胞有星形细胞的特征，这些细胞受到不同的刺激(如中风、癫痫发作等)后可增殖，形成有迁徙功能的成神经细胞，进而分化为颗粒细胞移入齿状回[13]。难治性颞叶癫痫患者的手术标本中可以分离出多能祖细胞并可分化为神经细胞系和胶质细胞系，同时来自癫痫动物模型的研究也发现，癫痫发作后海马神经元新生有明显的年龄依赖性，在生后3～4周，癫痫发作可以促进海马神经发生，癫痫发作可以促进神经发生且这种变化可以持续到成年期[14]。这些新生的海马神经元参与到癫痫形成的神经网络中增加了癫痫的易感性[13]。虽然抽搐发作引起的海马神经发生与癫痫易感性和继发海马功能障碍均相关，然而抽搐发作引起的海马神经发生的分子调控机制尚未明确[15]。
Wnts是一组分泌性糖蛋白，对生物体的多个方面都有调控作用，对细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡也至关重要[2]。目前大量研究证实，Wnt信号分子参与海马神经发生的调控，阻断Wnt信号通路可以消除齿状回海马神经发生[3]。目前已明确的3条Wnt信号通路中，Wnt/β-catenin通路是经典的Wnt信号通路[4]。Wnt可以作为配体的形式，与靶细胞膜上的卷曲蛋白(Frizzleds，Fz)受体及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein Receptor-related Proteins 5/6，LRP5/6)结合，作用于细胞质的散乱蛋白(DVL)，直接导致GSK-3β活性抑制，切断β-catenin降解途径，从而使β-catenin在细胞中积聚。当β-catenin积聚到一定量时，与细胞核内TCF/LEF转录复合物结合，而该复合物是一种转录激活因子，能引起Wnt/β-catenin信号通路的靶基因表达，从而发挥调控作用。DKK1是一种Wnt/β-catenin信号通路抑制剂，该抑制剂可与Wnt蛋白竞争结合LRP5/6受体，从而直接抑制Wnt/β-catenin信号通路，还可以通过Kremen蛋白与LRP5/6间接结合，并形成三聚体复合物，使LRP水平降低，阻滞Wnt信号向细胞内转导，并最终实现抑制Wnt/β-catenin信号通路的作用[16]。
本研究结果显示，通过KA致痫后在颞叶癫痫形成过程中，急性期KA组动物海马组织β-catenin、GSK-3β mRNA的表达较对照组显著下降，这可能与KA致痫后1周的神经病理学改变以组织细胞坏死所致的神经元缺失为主有关[17]。针对KA颞叶癫痫模型的研究发现，注射KA 6 h之后，注射KA侧海马CA1、CA3区及海马门区神经元会出现变性及坏死，且以CA3区最为显著[18]。
前期研究结果显示，在自发性反复癫痫形成初期，Wnt5a mRNA在海马组织中的表达较急性期升高，但无差异。在致痫的急性触发因素造成神经元损伤后，海马神经发生增强[13-14]，Wnt5a作为影响神经发生的调节因素，它的高表达可能与反复癫痫发作所致的大鼠海马神经发生有关，这些新生细胞大多数从颗粒下层迁移至颗粒细胞层，门区和分子层，并可分化为颗粒神经元，而这种新生的颗粒细胞，在形成异常的突触联系后会提高海马环路的兴奋性，并对发育中的脑神经网络的正常构建产生异常影响[19]。有资料显示，Wnt5a既能活化经典的Wnt/β-catenin通路，又能活化非经典的Wnt/Ca2+通路，这取决于Wnt5a与哪一种受体结合[20]。Wnt5a若作为配体激活经典的Wnt信号通路，可直接导致GSK-3β活性抑制，切断β-catenin降解途径，从而使β-catenin在细胞中积聚。本研究显示，癫痫形成初期GSK-3β mRNA的表达较急性期显著下降，而β-catenin mRNA的表达较前显著增高，符合经典wnt信号通路激活后下游分子表达的变化规律。故推测Wnt5a可能通过活化经典的Wnt/β-catenin通路参与癫痫形成过程中的海马神经发生。
当慢性癫痫稳定形成后，动物出现大量反复自发性惊厥，海马神经发生呈明显下降态势[21]。针对颞叶癫痫患者海马组织的研究发现，进入慢性期海马神经发生明显降低，这与KA诱发颞叶癫痫动物模型的海马病理学变化相符。进入慢性期的颞叶癫痫患者，其反复痫样发作与海马神经发生降低可能有一定的关系[22]。尽管关于颞叶癫痫慢性期海马神经发生减低的确切机制在目前尚无定论，但有研究表明，神经发生减低与新生细胞的神经分化能力显著降低密切相关[23]。颞叶癫痫伴海马硬化者的海马组织中Wnt蛋白抑制剂Dickkopf-1(DKK1)的免疫反应活性明显增强；而正常对照和癫痫发作但不伴海马神经元缺失者，其海马组织中DKK1的活性则检测不到或极低[5]。本课题组的前期实验结果显示，慢性癫痫稳定形成期，KA组动物海马组织中Wnt5a的表达较颞叶癫痫形成的急性期和慢性癫痫形成初期均明显增高且有差异。反复的痫性发作必然会导致海马神经元的损伤，海马神经发生能力可以持续终生，所以神经元损伤后神经发生势必存在，Wnt5a作为调控海马神经发生的信号分子也可能持续增加。分泌型抑制剂DKK可与LRP 5/6竞争性结合，起到抑制Wnt信号通路的作用。慢性稳定期Wnt5a的表达虽然明显增高，但由于分泌型抑制剂DKK活性的增强，可抑制Wnt5a信号分子发挥作用[5]，导致海马神经发生受阻，表现为慢性癫痫稳定形成后海马神经发生明显降低，出现慢性稳定期Wnt5a的表达明显增高。推测Wnt5a通过经典Wnt信号通路发挥作用，至慢性癫痫形成期，DKK的活性增加，可减少Wn5a与LRP 5/6结合，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。因此，GSK-3β的表达应增高，与本实验结果相符。依据经典的Wnt信号通路的作用机制，GSK-3β表达增多时，β-catenin将被降解，而GSK-3β表达降低时，β-catenin将逐渐积累，即β-catenin的变化会滞后于GSK-3β的变化。本实验结果显示，癫痫形成初期GSK-3β mRNA的表达较对照组显著下降，而此时β-catenin mRNA的表达较急性期明显增高，但较对照组仍低，直至慢性期β-catenin mRNA的表达较对照组显著增高。因此，本实验结果符合经典的Wnt信号通路激活，下游分子β-catenin和GSK-3β表达的变化规律。本研究结果提示可以增加β-catenin检测的时间窗，在KA致痫后12周检测β-catenin mRNA的变化，这将更有利于阐述经典的Wnt信号通路与海马神经发生的关系。
丙戊酸钠是常用的广谱抗痫药物之一。一般认为它作用于γ-氨基丁酸(GABA)的A亚单元可增加GABA的合成与释放，增加突触后成分与GABA的亲和力，从而增强神经传递；它还能阻断电压门控的钠内流，降低初级传入神经元的T 型钙内流，从而发挥抗癫痫作用[24]。目前研究发现，临床治疗剂量的丙戊酸钠可以通过Wnt信号通路治疗双相情感障碍[7]。此外有研究显示，丙戊酸钠暴露的孤独症模型鼠脑组织Wnt/β-catenin通路活性增加，当经典的Wnt信号通路功能增强，其靶基因表达上调[8]。但丙戊酸钠是否会通过Wnt信号通路调控海马神经发生而发挥其抗痫作用尚不十分明确。本实验研究结果显示，KA+VPA组大鼠海马组织GSK-3β和β-catenin mRNA的表达，在颞叶癫痫形成的过程中与相对应的KA组的表达有相同的变化趋势。与NS组相比在急性期GSK-3β，β-catenin mRNA的表达均显著下降但下降的趋势较KA组缓和，这可能与丙戊酸钠抑制神经元异常放电，减少癫痫发作，海马神经元的损伤较KA组明显减少有关。KA+VPA组和KA组之间大鼠海马组织β-catenin，GSK-3βmRNA的表达在KA点燃后颞叶癫痫形成的不同阶段无差异，说明丙戊酸钠在KA致痫模型癫痫产生的过程中对海马组织β-catenin和GSK-3β的表达没有影响，丙戊酸钠的抗痫作用机制与β-catenin和GSK-3β信号分子无关。
参考文献
1 Ming GL,Song H.Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.Annu Rev Neurosci,2005,28:223-250.
2 Zhang L,Yang X,Yang S,et al.The wnt/ beta-catenin signaling pathway in the adult neurogenesis.Eur J Neurosci,2011,33:1-8.
3 Inestrosa NC,Varela-Nallar L.Wnt signaling in neuronal differentiation and development.Cell Tissue Res,2015,359:215-223.
4 Huang H,He X.Wnt/beta-catenin signaling:new (and old) players and new insights.Curr Opin Cell Biol,2008,20:119-125.
5 Busceti CL,Biagioni F,Aronica E,et al.Induction of the Wnt inhibitor,Dickkopf-1,is associated with neurodegeneration related to temporal lobeepilepsy.Epilepsia,2007,48:694-705.
6 Miller JR .The Wnts.Genome Biol ,2003 ,3:1-15.
7 Rosenberg G.The mechanisms of action of valproate in neuropsychiatric disorders:can we see the forest for the trees? Cell Mol Life Sci,2007,64:2090-2103.
8 Wang Z,Xu L.Demethylation of specific Wnt/β-catenin pathway genes and its upregulation in rat brain induced by prenatal valproate exposure.Anat Rec (Hoboken),2010,293:1947-1953.
9 Wang L,Liu Y,LiS,et al.Wnt signaling pathway participates in valproic acid-induced neuronal differentiation of neural stem cells.Int J Clin Exp Pathol,2015,8:578-585.
10 Ben-Ari Y,Tremblay E,Riche D,et al.Electrographic,clinical and pathological alterations following systemic administration of kainic acid,bicuculline and pentetrazole:metabolic mapping using the deoxyglucose method with special reference to the pathology of epilepsy.Neuroscience,1981,6:1361-1391.
11 Stafstrom CE,ChronopoulosA,Thurber S,et al.Age-dependent cognitive and behavioral deficits after kainic acid seizures.Epilepsia,1993,34:420-432.
12 RacineRJ,Okujava V,Chipashvili S.Modification of seizure activity by electrical stimulation.Electroencephlogr Clin Neurophysiol,1972,32:281-294.
13 Siebzehnrubi FA,Blumcke I.Neurogenesis in the human hippocampus and its relevance to temporal lobe epilepsies.Epilepsia,2008,49:56-65.
14 Porter BE.Neurogenesis and epilepsy in the developing brain.Epilepsia,2008,49:50-54.
15 Parent JM,Elliott RC,Pleasure SJ,et al.Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy.Ann Neurol,2006,59:81-91.
16 ScottEL,Brann DW.Estrogen regulation of Dkk1 and Wnt/β-Catenin signaling in neurodegenerative disease.Brain Research,2013,1514:63-74.
17 Sperk G,Lasssmann H,Baran H,et al.Kainic acid induced seizures:neurochemical and histopathological changes.Neuroscience,1983,10:1301-1315.
18 Dunleavy M,Shinoda S,Schindler C,et al.Experimental neonatal status epilepticus and the development of temporal lobe epilepsy with unilateral hippocampal sclerosis.Am J Pathol,2010,176:330-342.
19 Blümcke I,Schewe JC,Normann S,et al.Increase of nestin-immunoreactive neural precursor cells in the dentate gyrus of pediatric patients with early-onset temporal lobeepilepsy.Hippocampus,2001,11:311-321.
20 Mikels AJ,Nusse R.Purified Wnt5a protein activates or inhibits β-catenin-TCF signaling dpending on receptor context.Plos Biol,2006,4:e115-e116.
21 Hattiangady B,Rao MS,Shetty AK.Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus.Neurobiol Dis,2004,17:473-490.
22 Fahrner A,Kann G,Flubacher A,et al.Granule cell dispersion is not accompanied by enhanced neurogenesis in temporal lobe epilepsy patients.Exp Neurol,2007,203:320-332.
23 Kuruba R,Hattigangady B,Shetty AK.Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy.Epilepsy Behav,2009,14:65-73.
24 Loscher W.Valproate:a reappraisal of its pharmacodynamic properties and mechanisms of action.Prog Neurobiol,1999,58:31-59.