宫颈癌是一种恶性妇科肿瘤，在全世界范围内每年约有50万人新确诊为宫颈癌，同时约有30万人死于宫颈癌，9%的女性肿瘤患者的死因是宫颈癌，在全世界范围内，宫颈癌已成为对妇女健康构成威胁的恶性肿瘤［1］。高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的首要因素，在世界不同地区的宫颈癌患者中，HPV16感染所占的比例最高。在HPV16阳性的妇女中，仅有一小部分人的感染会引发宫颈癌变，一些研究指出，HPV16基因变异可能与之有一定的关系［2-4］。在病毒进化过程中，HPV16基因会自然发生一些核苷酸突变，产生变异体/变异株(variants，核苷酸变异数＜2%定义为变异体)，并逐渐形成谱系。在世界各地不同族群妇女中，HPV16变异体主要流行的谱系有所不同。HPV16变异体核苷酸序列的改变，可能导致相应编码的氨基酸替换和病毒生物学特性、免疫原性的改变，从而在一定程度上影响着病毒的致癌能力。
本文拟对新疆地区妇女宫颈HPVDNA16型阳性患者进行LCR、E6、E7 PCR扩增后测序，以明确新疆地区妇女感染的HPV16型是主要属于哪几个变异体谱系，是否也存在一些族群特异性的突变，从而导致了病毒致癌的风险性的改变及E6、E7、LCR基因突变研究，为该地区宫颈癌组织中感染HPV16基因突变研究积累分子流行病学资料。
对象与方法
一、对象
1.研究对象的纳入和排除标准:2014年12月到2015年8月在本院门诊及住院行宫颈癌筛查，经COBAS高危型HPV分型检测、导流杂交基因芯片HPV分型检测，结果为HPV16型阳性的妇女为研究对象，均有诊断明确的宫颈组织病理学结果，留取宫颈液基细胞学样本及COBAS分型检测提取的DNA样本。
排除标准包括(1)既往有宫颈癌或者宫颈局部不明肿瘤史;(2)目前正在妊娠或者妊娠终止3个月内者;(3)宫颈发育异常如双宫颈、先天性子宫缺如者;(4)具有宫颈局部切除史或放疗、化疗者;(5)手术切除子宫者;(6)剩余液基细胞样本量不足;(7)样本结果不符合纳入标准;(8)信息不全的标本。
2.研究对象基本情况:共收集HPV16型阳性患者样本115例。维吾尔族妇女65例，其中宫颈炎10例，CINⅠ0例，CINⅡ6例，CINⅢ20例，宫颈癌29例。汉族妇女50例，其中宫颈炎16例，CINⅠ5例，CINⅡ7例，CINⅢ14例，宫颈癌8例。见表1。
表1 研究对象的一般情况［例(%)］
二、实验方法
1.宫颈脱落细胞样本采集:患者排空膀胱取截石位，用窥阴镜观察并暴露子宫颈，细胞学专用采样刷，放置于宫颈口朝一个方向旋转3～5周(1周为360°，将宫颈定义为一个圆)，尽量多的刷取宫颈鳞柱交界处得脱落细胞，将脱落细胞放置于细胞保存液中，编号保存，待分型检测。
2.COBAS高危型HPV分型检测:使用COBAS HPV检测系统对样本进行分型检测，明确HPV16型行测序。
3.HybrMiax HPV分型检测:使用HybriMax医用核酸分子快速杂交仪(人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒，HZB25A，凯普生物科技有限公司)对样本进行分型检测，明确HPV型行测序。
4.基因组DNA提取:采用细胞基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型，ZPM308，北京庄盟生物有限公司)提取宫颈液基细胞中DNA，具体操作方法根据试剂盒说明书操作。
5.HPV16型信息:E6基因位于HPV基因组早期基因区上，NCBI的登录号为NC_001526.2，基因从83位碱基到559位碱基，全长477 bP。E7基因
位于HPV基因组早期基因区上，NCBI的登录号为NC_001526.2，基因从562位碱基到858位碱基，全长297 bP。HPV E6/E7基因信息见图1、图2。
NC_001526.2
图1 E6基因在HPV的位置
NC_001526.2
图2 E7基因在HPV的位置
6.PCR引物:根据Genebank中HPV16标准株序列，设计跨E6、E7基因及调控区引物，引物序列包括上游引物 AACGCCTTACATACCGCTG(5’→3’)和下游引物 GCTGTCTCTGTTTCTGCCTG(5’→3’)。利用上述引物对样本基因组进行PCR实验，PCR产物序列包含HPV 16型E6、E7、调控区基因。
7.建立PCR反应体系:利用梯度PCR的方法筛选出最优的聚合酶链反应体系及实验条件，聚合酶链反应体系见表2，聚合酶链反应条件为循环参数要求94℃预变性30 s;94℃变性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸30 s;循环 39次;后于72℃延伸2 min。聚合酶链实验结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳质检，条带单一，并且无非特异性扩增条带为合格PCR产物。
表2 PCR反应体系
8.PCR产物纯化及回收:采用切胶回收的方法进行PCR产物的纯化，切掉少量非特异的扩增产物，也可去除PCR反应体系中的离子、剩余的dNTPs等影响酶切和测序反应的杂质，得到单一的目的产物。115个PCR纯化产物送至华大基因测序。
9.PCR产物序列测定:PCR扩增产物经纯化后，对扩增产物直接进行测序分析。将测序结果与HPV16型序列(NC_001526.2)进行对比分析，有碱基改变的位点就是其突变位点，突变位点以全基因组第一个位点为起始，如T350G表示HPV16阳性样本中E6基因上第350号位的碱基T被G替换。氨基酸的突变也是与 HPV16(NC_001526.2)进行比对。
10.统计学处理:比较基因序列数据库中HPV16的E6、E7和LCR基因序列与样品中已测序列的E6、E7和LCR基因序列，用DNAMAN软件比对分析HPV16 E6、E7和LCR基因区的核苷酸序列改变情况。采用Mega5.1的Neighbor-joining方法对115个样本的E6基因的477bP(nt83～nt559)DNA片段序列、E7基因的297 bP(nt562～nt858)DNA片段序列和调控区基因的82bP(nt 1～nt82)DNA片段序列与已知HPV16的5大亚型序列进行多重比对和进化树分析，构建系统发生树(靴值法(BootstraP method)检验系统发生树，重复数为1 000)，并讨论其同源关系。维吾尔族与汉族之间突变差异进行分析比较用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
结 果
一、样本DNA提取、PCR及测序实验结果
1.样本DNA提取:样品DNA为单一的条带(见图3)，经核酸蛋白定量仪检测DNA含量，260/280的比值在1.7～2.1之间，260/230的比值在1.71左右。
经核酸蛋白定量仪检测，大部分样本260/280的数值在1.7-2.1。代表DNA质检纯度较高，没有蛋白及碳水化合物污染。
2.PCR产物电泳:PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳质检，在1 292 bP处有单一条带，(见图4)无非特异性的扩增条带，扩增条带为合格的PCR产物。
二、PCR产物测序分析
1.HPV16型E6、E7、LCR基因变异分析:115例样本的E6、E7基因均成功扩增并测序。结果发现115例样本中E6基因有92例发生基因突变，突变率为80.00%(92/115)，共涉及到16个位点突变。其中碱基突变概率最高的是T350G(55例，占总变样本的59.78%)，导致了L83V氨基酸突变。有17例发生了T178G碱基突变(占总突变样本的18.48%(17/92))，导致了D25E氨基酸突变。此外，有1例发生了 G94A碱基突变，1例发生了G106T碱基突变，2例发生了T109C碱基突变，2例发生了G144T碱基突变，1例发生了C245T碱基突变，1例发生了 A257G碱基突变，有1例发生了T285A碱基突变，有1例发生了A288G碱基突变，有4例发生了 T295G碱基突变，有1例发生了C334T碱基突变，有2例发生了T406C碱基突变，有2例发生了T412C碱基突变，有1例发生了G418碱基缺失，有1例发生了G534C碱基突变。
115例样本中E7基因有63例发生基因突变，突变率为54.78%，共涉及到14个位点突变。碱基突变率最高的是 A647G(21例，占突变样本的33.33%)，导致了 N29S氨基酸突变。其次是T846C(17例，占突变样本的26.98%)，导致了同义突变。此外，有2例样本发生和T846G碱基突变;有2例样本发生和C627T碱基突变，导致了1例L22F氨基酸突变;有3例样本发生T760C碱基突变;4例样本发生G666A碱基突变;1例样本发生G745A碱基突变;1例样本发生T789C碱基突变;有2例样本发生C790T碱基突变;有3例样本发生T795G碱基突变;有1例样本发生A822T碱基突变;有2例样本发生G823T碱基突变;有2例样本发生T843C碱基突变;有1例样本发生G849C碱基突变;有1例样本发生G613A碱基突变。
115例样本中LCR调控区基因有27例发生基因突变，突变率为23.48%，共涉及到2个位点突变，其中有2例发生了C13G碱基突变，其中有5例发生了C13T碱基突变(占突变样本的18.52%，5/27)，其中有20例发生了C24T碱基突变(占突变样本的74.07%，20/27)。全部为单一碱基发生突变共27例。
图5 对E6的477bP片段构建进化树
2.HPV 16型E6、E7、LCR调控区DNA序列亚型分类分析:本研究中所有变异体的分类参考文献报道［5-6］，HPV16的序列 NCBI的登录号为 NC_001526.2，核苷酸位置以德国标准株序列，即欧洲原型进行比较。HPV16变异体的欧洲-亚洲这一分支可根据6个核苷酸位点来确定，分别为E6的三个核苷酸位点分别为145G、286T和289A，调控区三个位点分别为7489G、7764C和7786C，其中亚洲型(As)可根据E6基因178位点的核苷酸突变来确定，即亚洲型特有的D25E突变。北美型(NA)和亚洲美洲型(AA)这一支可根据12个核苷酸位点突变来确定分别为E6基因中的5个突变位点的分别是G145T，T286A，A289G，C350T，T350G 突变，调控区的 7 个突变位点分别为 A7233C，A7485C，G7489A，C7669T，C7689A，C7764T和 C7786T的突变。采用Mega5.1软件Neighbor-joining方法对115例HPV-16型样本的E6基因的477bP(基因序列位置nt 83～nt 559)DNA片段及E7的297 bP(基因序列位置nt562～nt 858)DNA片段构建进化树。根据进化树结果显示，115样本中有41例与标准株相同即欧洲型，亚洲型(As)26例，亚洲新疆型(XJ)38例，欧洲型9例，且这9例欧洲型由进化树分析也均属于亚洲新疆型，1例亚洲美洲型。无非洲1型(Af-1)和非洲2型(Af-2)。结果见图5、图6。
图6 对E7的297bP片段构建进化树
3.新疆维吾尔族与汉族HPV 16型阳性高危型患者基因突变位点情况分析:对新疆地区维吾尔族及汉族HPV16型阳性高危患者E6基因突变进行分析，汉族发生突变频率较高的位点为T350G，这个位点突变发生占汉族变异位点总数45.24%(19/42);T178G，这个位点突变发生占汉族变异位点总数的30.95%(13/42);维吾尔族发生突变频率较高的位点只有T350G，这个位点突变发生占维吾尔族变异位点总数72.00%(36/50)，维吾尔族妇女T350G突变率显著高于汉族，差异具有统计学意义。见表3。
对新疆地区维吾尔族及汉族HPV 16型阳性高危患者E7基因突变进行分析，汉族发生突变频率较高的位点为A647G，这个位点突变发生占汉族变异位点总数33.33%(16/48);T846C，这个位点突变发生占汉族变异位点总数31.25%(15/48)。维吾尔族特异性变异位点也为A647G(20.00%，3/15)和T846C(13.33%，2/15)。汉族 A647G、T846C突变率显著高于维吾尔族，差异具有统计学意义，结果见表4。
表3 新疆汉族及维吾尔族HPV 16型感染者E6基因突变位点［例］
注:*P＜0.05
表4 新疆汉族及维吾尔族HPV 16型感染者E7基因突变位点［例］
注:*P＜0.05
新疆地区维吾尔族及汉族HPV 16型阳性高危患者调控区(LCR区)基因有27例出现突变，突变率为23.48%(27/115)。碱基突变位点均位于C13T及C24T。汉族及维吾尔族该区特征性突变位点均为 C24T，突变率分别为78.95%(15/19)和62.50%(5/8)，且汉族妇女在该位点的突变率显著高于维吾尔族，差异具有统计学意义。因维吾尔族妇女在LCR区突变例数仅为8例，样本数较少，差异未见统计学意义。结果见表5。
表5 新疆汉族及维吾尔族HPV 16型感染者调控区基因突变位点［例］
注:*P＜0.05
讨 论
高危型HPV感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌的首要元凶，随着宫颈癌病因的明确，越来越多的研究转向以HPV感染为研究重点，新疆维吾尔族妇女是宫颈癌的高发人群，针对该地区妇女感染的HPV16 E6、E7及LCR其调控区基因突变情况进行分析具有非常重要的意义。
一、HPV16型 E6、E7、LCR 基因突变情况
HPV16型基因突变与人种及所在地域存在一定关系。目前已有大量研究证明［7］，亚洲型(As)可根据E6基因178位点的核苷酸T-G突变来确定，即亚洲型特有的D25E突变;欧洲型可根据E6基因350位点的核苷酸T-G突变来确定，即欧洲型特有的L83V(亮氨酸变为缬氨酸)突变;北美型(NA)和亚洲美洲型(AA)这一支可根据E6基因G145T、T286A、A289G、C350T和 T350G突变及调控区A7233C、A7485C、G7489A、C7669T、C7689A、C7764T和C7786T的突变来确定［8-9］。这些突变与所在地域HPV的感染及癌前病变的临床进展有者密不可分的关系。根据进化树结果，可见新疆汉族人种感染的HPV16主要为亚洲型，这与文献报道的研究结果吻合［10-11］。有研究发现在亚洲常见的HPV16E6变异株T178G，属于亚洲型(As)分支，在西方国家很少见到［12-13］。考虑新疆地区汉族人种与亚洲人种在物种同源。同时，本研究中55例发生T350G突变的患者中维吾尔族占72.00%，提示新疆维吾尔族与欧美人种之间存在物种同源性，而汉族人中也存在T350G突变，这可能与新疆地域性有关，有部分汉族人感染了维吾尔族妇女携带的欧洲型HPV16型。本研究中E6突变率为80.00%主要突变位点 T350G(59.78%)，T178G(18.47%)，说明E6基因突变以单基因突变为主，并且以T350G为主，与文献报道相一致［14］。
本研究对E7基因突变有63例，E7突变率为54.78%分析显示，最多见的突变为 A647G 21例，占突变样本的33.33%，导致了N29S氨基酸突变。其次是T846C 17例，占突变样本的26.98%。本研究表明E7突变多发生在汉族人中，E7基因突变率中汉族与维吾尔族比较差异具有统计学意义，可能与维吾尔族中E7序列相对于汉族较为较为保守有关，与文献报道相一致［15］。
本研究中LCR调控区基因有27例发生基因突变，突变率为23.48%，其中有5例发生了C13T碱基突变，其中有20例发生了C24T碱基突变。全部为单一碱基发生突变共27例。汉族C13T、C24T突变率比维吾尔族中显著高，与文献报道的突变情况较为一致［16］。本研究分别以E6及E7基因的碱基序列信息构建基因进化树，发现E6、E7两者之间有冲突，但与基因序列分析结果一致。因此，通过进化树的分析，本研究只能大概看出新疆地区少数民族及汉族HPV16亚型分布的情况。即新疆地区妇女感染的HPV16型只有亚洲型、亚洲新疆型及欧洲型，无非洲型1型、非洲2型及美洲型。由于HPV16型E6和E7的序列变异直接与E6及E7癌蛋白的突变有关，故该结果为以后设计新疆地区少数民族适用的宫颈癌疫苗提供了数据参考。
二、维吾尔族与汉族HPV16E6、E7、LCR基因变异分析
本研究E6基因变异中主要变异位点为T350G(59.78%)和T178G(18.47%)，维吾尔族中多发生的突变位点为 T350G，汉族中多发突变位点为T350G、T178C。说明在新疆E6主要以欧洲型突变，亚洲型突变为主，与相关文献报道较为一致［17］。T350G的突变率维吾尔族明显高于汉族，与文献报道的相一致。T350G的碱基替换与HPV16型的高致癌性有关。T178C的突变率汉族明显高于维吾尔族，E7基因变异中主要变异位点为 A647G和T846C，维吾尔族HPV16 E7基因 A647G和T846C位点突变率低于汉族，本研究［18］的结论与前期学者的研究在部分观点是一致的认为A647G突变率在新疆属于主要突变位点，并且在新疆地区维吾尔族和汉族妇女宫颈病变不同阶段的突变率存在差异，共同认为该突变对宫颈癌的发病可能有影响。但与其在民族间突变率比较存在分歧，考虑是否与患者来自地域不同造成突变率不同，从而影响到统计结果。LCR基因变异体中因维吾尔族突变例数能从数据结果显示C24T突变率中汉族高于维吾尔族，本部研究值得继续进行，目前的研究结果对新疆地区HPV16变异体继续深入研究奠定了基础。
(图3、图4)
新疆地区HPV16型变异体及E6、E7、LCR基因变异分析
图3 部分基因组电泳检测结果
注:左侧条带为DNA marker 2000，条带依次为2 000 bP、1 000 bP、750 bP、500 bP、250 bP、100 bP
图4 部分基因组PCR产物电泳图
注:左侧条带为DNA marker 2000，条带依次为2 000 bP、1 500 bP、1 000 bP、750 bP、500 bP、250 bP、100 bP
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