胚胎冷冻是试管婴儿治疗的不可或缺的技术之一，超排卵治疗可在一个治疗周期得到多个胚胎，将移植后多余胚胎冷冻保存，提高了胚胎的利用率和每个治疗周期的累计妊娠率［1］。囊胚比卵裂期胚胎种植率高，在人类辅助生殖治疗中，单囊胚移植可减少多胎妊娠带来的母婴并发症并提高治疗效果。
2001年Yokota等［2］报道第一例囊胚玻璃化冷冻复苏获得妊娠。由于玻璃化冷冻技术具有效果好，操作简单快速等优点，得到了迅速发展并广泛用于辅助生殖领域。
尽管大量文献报道，玻璃化冷冻的囊胚可以获得令人满意的妊娠率［3-4］，并且已诞生了正常婴儿，但因高浓度冷冻保护剂的潜在细胞毒性，囊胚玻璃化冷冻的安全性一直是辅助生殖工作者关心的问题。笔者复习文献发现，安全性研究大都集中在冷冻复苏对胚胎发育潜能和对围产期或新生儿期的影响［5-7］，少有该技术对生长发育的长期随访，如运动功能、学习记忆、社交能力等，更因囊胚玻璃化冷冻出生的孩子没有大批进入生育年龄，该技术对生殖力的影响目前还没有报道。本文拟通过观察小鼠玻璃化冷冻囊胚的仔鼠生长发育、成年后行为学和生殖能力变化，来进一步说明囊胚玻璃化冷冻对子代安全的长期影响，为辅助生殖治疗安全性提供参考。
材料与方法
一、小鼠和主要试剂
C57BL/6和ICR小鼠由南通大学实验动物中心提供，SPF级环境饲养。孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性激素(hCG)均购于宁波激素制品有限公司，胚胎操作相关试剂购于Vitrilife(瑞典)，所有动物实验均得到南通大学实验动物中心批准。
二、囊胚收集和冷冻复苏
选用C57BL/6小鼠超排卵收集囊胚，取性成熟期前雌鼠(3～4周龄)200只，分次超排。合笼雌鼠于见栓后72 h脱颈处死，取出子宫，以G-MOPS+冲洗子宫腔，收集囊胚。据Gardner囊胚评分标准［8］，选优质囊胚进行玻璃化冷冻保存，参照Desai的玻璃化冷冻复苏法［9］。
三、囊胚复苏移植
囊胚冷冻2周后复苏后培养3～4 h，选择优质胚胎移植到见拴后2.5 d的ICR假孕鼠子宫中。妊娠16.5 d自然分娩后观察仔鼠外观和发育情况，记录产仔数。
四、生长发育分析
囊胚冷冻移植组为实验组，C57BL/6自然繁育组为对照组。
1.早期发育:仔鼠出生当日定为D0，记录每窝产仔数、观察新生鼠外观有无畸形，上下牙萌出、耳廓分离等生理指标。
2.运动协调 -转轮试验(Rotarod Test):将小鼠放到一根水平转动杆上，小鼠经过训练后水平杆转速加快，记录每次小鼠从放到杆上到滑落时间或者持续逗留到5 min。
3.学习记忆-Morris水迷宫实验:实验前1 d不放置平台，让小鼠自由游泳1min。实验分三部分进行，分别为定位航行试验，空间搜索实验和工作记忆实验。测量记录小鼠上台潜伏期、总路程、穿越站台次数和站台象限停留时间。
4. 社交能力-Crawley＇s 社交测试法［10］;在透明三厢测试盒的两侧分别放置1个完全相同带网洞的小笼，其中一侧的小笼内放1只陌生鼠，另外一侧小笼空置，将受试鼠放置于中间厢，观察记录受试鼠与陌生鼠和空笼的接触时间，测试时间10 min。
五、生殖力检测:囊胚冷冻组和对照组均于8周龄开始交配实验，每组雄鼠6只，分别与自然出生的母鼠配对，按照♂:♀=1:2比例合笼，次晨起每天上午捡栓，将见栓母鼠分笼并加入新母鼠，连续观察8周。计算雄鼠生育指数(妊娠母鼠/交配母鼠)，平均每窝仔鼠数。
六、睾丸组织学检查:交配实验结束后取睾丸附睾及心肝肾等主要脏器，10%福尔马林固定、石蜡包埋、切片HE染色。睾丸病理以曲精小管上皮细胞层次、生精细胞、间质细胞、支持细胞等改变判断生精功能。
七、统计学处理:采用GraphPad Prism 5统计软件分析处理数据，描述资料用均数±标准差表示，采用t检验比较两组之间的差异，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
结 果
一、仔鼠一般发育情况
囊胚冷冻移植组20只、对照组20只，仔鼠出生当天均外观正常，通体色红，双眼闭合，四肢形态正常活动自如，雄鼠性别比为48%。各组均无早产、流产，无死产、死胎。全身绒毛、睁眼等发育指标两组无明显差异。仔鼠生理发育变化，见图1。
图1 囊胚玻璃化冷冻仔鼠发育指标
二、行为学相关测试
1.平衡和运动协调功能:转轮实验用于测试小鼠平衡和运动协调功能，共测试了21 d，6个时间点，每组各10只。结果发现，小鼠在测试第3天(D3)达到转轮停留最长时间，囊胚冷冻仔鼠在转轮速度和停留时间上和对照鼠相当，两组差异无统计学意义，说明囊胚玻璃化冷冻没有影响小鼠的平衡和运动协调功能，见图2。
图2 转轮实验
2.学习记忆:Morris水迷宫是测试小鼠特殊学习和记忆功能的方法，每组各15只。本实验结果表明，囊胚冷冻仔鼠在第1～4天(D1～D4)找到水迷宫站台时间和路程没有差异，提示囊胚玻璃化冷冻对小鼠的学习没有影响。囊胚冷冻仔鼠第7天(D7)进入原站台位置的次数和停留时间与对照组比较，差异没有统计学意义。见表1。
3.社交能力:本项测试通过记录受试鼠与陌生鼠和空笼接触时间来了解社交能力，每组各10只。囊胚玻璃化冷冻鼠与陌生鼠接触时间和与空笼接触时间分别为(392.5±93.8)秒和(164.0±26.6)秒，差异有统计学意义，这与对照鼠的社交能力测试结果一致［与陌生鼠接触时间vs与空笼接触时间:(346.0±43.0)秒 vs(138.8±18.8)秒，差异有统计学意义］。与对照鼠一样，囊胚玻璃化冷冻鼠与陌生鼠接触时间明显多于与空笼接触时间，表明囊胚玻璃化冷冻鼠有正常的社交行为，见图3;两组小鼠与有陌生鼠笼的接触时间差异无统计学意义，与空笼的接触时间两组间也无统计学差异。
表1 水迷宫实验
图3 社交能力测试
注:两组小鼠与陌生鼠接触时间均明显长于与空笼接触时间
三、睾丸发育和生精功能
小鼠在4个月龄完成交配实验后取睾丸，大体和镜下观察发现囊胚玻璃化冷冻小鼠睾丸的解剖结构和生精功能均和对照组无明显差别，见图4。
四、生殖力
选择了交配试验测试小鼠的生殖力，每组交配母鼠数、妊娠率和产仔数，见表2，两组的生殖力和产仔数差异无统计学意义，说明囊胚玻璃化冷冻不影响仔鼠的生殖力。
图4 囊胚冷冻组和对照组睾丸组织切片HE染色
表2 交配试验
讨 论
在人类辅助生殖技术中，由于囊胚移植具有独特的优势，单囊胚移植已比较普遍。随之而来的是发展安全、可靠的剩余囊胚冷冻保存方法。与卵裂期胚胎相比，囊胚体积大水份多，传统的慢速冷冻复苏后存活率低。玻璃化冷冻技术是近十多年来应用于临床的胚胎冻存方法，该方法利用高浓度的冷冻保护剂，在胚胎冷冻过程中没有冰晶形成。囊胚玻璃化冷冻复苏有稳定的高成活率［11-12］，但玻璃化冷冻的安全性值得关注。囊胚玻璃化冷冻移植对儿童期的研究较少，仅Takahashi等［13］对囊胚玻璃化冷冻移植出生的147个新生儿情况有描述，先天畸形发生率为1.4%，与新鲜囊胚移植相似，其他研究主要注重早产和新生儿体重。囊胚玻璃化冷冻是否对远期子代健康和生殖力有影响，还需要更长时间的随访追踪调查。
因小鼠生长繁殖快，短时间内就可以观察到生命各阶段的生理特点，所以本实验选用了小鼠囊胚期胚胎来研究玻璃化冷冻的安全性。目前，小鼠胚胎冷冻方法与人类胚胎冷冻不尽相同，没有规范的操作标准。为了使小鼠胚胎玻璃化冷冻结果对临床有更好的指导作用，本实验采用了与人胚胎冷冻完全一致的操作方法和材料。囊胚玻璃化冷冻复苏小鼠生理发育指标测试结果提示与自然受孕小鼠无明显差异，各主要器官如心肝肾的大体和镜下结构都未发现异常，运动协调和学习功能指标也没有受到影响，囊胚冷冻组的记忆能力与对照组虽然差异没有统计学意义，但数值有下降趋势，需要继续观察。
社交是动物适应社会和生存发展的重要能力之一，许多神经心理方面异常可通过社交能力检测发现，从小鼠的测试结果来看，囊胚玻璃化冷冻出生的小鼠和自然受孕小鼠一样有正常的社交能力。虽然从数值上看囊胚冷冻组和空笼及陌生鼠接触时间偏长，但是和对照组相比，差异没有统计学意义。笔者查阅文献，未发现有关囊胚玻璃化冷冻对子代生殖力影响的报道，这与玻璃化冷冻技术临床应用时间较短，子代尚未大批达到生育年龄有关。为评估囊胚玻璃化冷冻是否影响雄性仔鼠生殖力，本实验设计了交配实验［14］，雄性小鼠在2个月的实验时间中，生殖力和产仔数均与对照组相当，睾丸病理学检查表明囊胚冷冻鼠的生精功能正常。初步结论认为囊胚玻璃化冷冻不影响雄鼠的生殖力，但该技术对雄性仔鼠生殖力的长期影响以及对雌鼠的生殖力的影响有待进一步研究。
总之，本实验通过小鼠囊胚期玻璃化冷冻复苏移植和自然受孕子代的生长发育、行为学特征特别是生殖力检测结果表明，小鼠囊胚玻璃化冷冻是安全的。但囊胚玻璃化冷冻技术对子代的长期影响及子二代的安全性研究仍在进行，希望通过本实验为人类囊胚玻璃化冷冻安全性提供参考。
参考文献
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