多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)为内分泌及代谢紊乱异常的疾病，在育龄女性中的发病率约为5% ～10%［1-3］，主要表现为不孕，易合并胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖和心血管疾病等代谢障碍性疾病。miRNA是长度为18～24个核苷酸的非编码小RNA，能够抑制靶基因转录后的表达［4］。由于血清miRNA稳定且易于检测，可作为疾病的血清特异性标志物［5］，但 PCOS患者血清中miRNA的表达情况尚不清楚。最新研究表明，miRNA-146a与炎症过程、激素代谢、脂肪形成和胰岛素信号通路相关，由此推测其在PCOS患者中也参与一定的作用［6］。本文就 PCOS患者血清中miRNA-146a的表达情况进行分析，以期对临床诊断提供一定的基础数据支持。
资料与方法
1.临床资料:选择2013年2月—2015年9月在本院妇产科检查的PCOS患者50例作为观察组，所有患者均符合鹿特丹PCOS诊断标准［7］，即明显的高雄激素血症、月经周期高于35 d以及超声显示双侧卵巢窦卵泡数高于12枚等。PCOS患者的年龄范围为23～37岁，平均年龄(28.3±5.5)岁。随机数字表法选取50例经诊断无雄激素过多或排卵功能异常的健康女性作为对照组，其年龄范围为21～40岁，平均年龄(27.1±3.6)岁。两组均无卵巢肿瘤和放化疗史，无甲状腺功能亢进/减退症等相关的内分泌疾病。对以上两组研究对象的临床年龄、体重和BMI一般指标进行比较，差异无统计学意义，两组具有可比性。见表1。
表1 两组基本临床资料对比
2.方法:所有入组的患者首先检测睾酮、催乳素、黄体生成素、卵泡刺激素、雌激素、葡萄糖和胰岛素生化指标。同时，采集静脉促凝血5 ml，以每分钟4 000转的转速离心10 min，随后每分钟12 000转离心15 min，去除残留的细胞碎片。对全血总RNA提取采用QIAGEN miRNAeasy Mini kit试剂盒进行抽提。采用NanoDrop 2000仪器对各样本提取的RNA浓度及260/280检测其纯度。运用ABI公司TaqMan miRNA逆转录试剂盒将各样本总RNA进行反转录为cDNA。本次QPCR的内参为RNU6B。miRNA-146a和RNU6B的TaqMan探针由ABI公司合成。采用TaqMan PCR试剂盒对miRNA-146a和RNU6B进行qRT-PCR，仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪，每个标本均有3个复孔。miRNA的相对表达水平为2-ΔCT，ΔCT=CT目的-CT内参。
3.统计学处理:应用SPSS17.0进行数据统计分析，计量资料采用(珋x±s)表示，组间比较采用t检验，血清miRNA-146a水平和睾酮的相关性采用简单线性回归分析，以P﹤0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.两组患者生化指标结果对比:观察组患者睾酮、黄体生成素、雌激素、葡萄糖、胰岛素和催乳素的水平均显著高于对照组，卵泡刺激素水平低于对照组，两组差异均有统计学意义。见表2。
表2 两组患者生化指标对比
注:与对照组比较，*P＜0.05
2.两组患者血清miRNA-146a的表达水平比较:由图1可以看出，观察组患者miRNA-146a血清表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义。
图1 两组患者血清miRNA-146a的表达水平比较
3.观察组患者血清miRNA-146a水平和睾酮的相关性:通过线性回归分析发现，血清中miRNA-146a表达水平和睾酮浓度呈显著的负相关性(R2=0.798;P＜0.001)(图2)。
图2 PCOS患者血清miRNA-146a水平和睾酮的相关性
讨论
目前，PCOS作为卵巢功能失调综合征，其发病原因仍然还不清楚，临床上表现为高度的异质性。近年来，PCOS患病人数不断增加，严重威胁到女性特别是生育期阶段妇女的生命安全。PCOS临床上的特征为稀发排卵或无排卵，同时出现高雄激素血症、肥胖及月经不规律。一直以来，内分泌激素的水平可作为评价PCOS患者病情发展的主要指标，但据此仍然不能精准的进行诊断［8］。miRNA在PCOS患者的发病机制中起到重要的作用，且miRNA可作为PCOS等疾病的生物标志物。高雄激素PCOS患者卵巢颗粒细胞中的miRNA-21和miRNA-25表达水平与疾病发展密切相关。同时，miRNA-21水平在2型糖尿病和心血管患者处于下调的趋势［9］。
已有报道［10］显示PCOS患者卵巢组织中不同miRNA水平表达不同，如miRNA21和miRNA-146a等，但血清中相关的miRNA则还没有过多的报道。有研究［11］认为miRNA-146a的靶基因参与细胞周期、细胞凋亡、内分泌信号通路(Wnt、MAPK和JAKSTAT)等生理功能，miRNA-146a能够抑制孕酮、雄激素和雌激素的释放，推测其可能为生理分泌活动的抑制剂。Long等［12］研究表明miRNA在PCOS患者卵巢组织中表达异常，但是有可能是因为其未释放入血，所以血浆中并未发现改变。目前为止，发现在PCOS患者血浆中表达异常的miRNA主要包括miRNA-21、miRNA-27b、miRNA-103、miRNA-155、miRNA-222、miRNA-30c 及 miRNA-146a。这 些miRNA在PCOS患者血浆中表达均上调。其中，miRNA-21、miRNA-27b以及miRNA-155的表达与血清中游离睾酮水平呈正相关，而miRNA-146a的变化与血清中游离睾酮水平呈负相关［12］。高雄激素血症是早期预示PCOS疾病的重要独立危险因素，且PCOS患者代谢功能障碍严重，常常伴随肥胖等代谢异常及心血管疾病等并发症。PCOS患者睾酮和黄体生成激素分泌增加，雌激素水平也可能受影响，Murri等［13］发现，雌激素对 miRNA-21、miRNA-103和miRNA-146a的表达有积极作用。miRNA可能通过影响卵巢激素的合成而影响PCOS的发病及症状，另外很多研究关注了miRNA在胰岛素抵抗中的可能作用，有研究总结了患者在肝脏、脂肪和肌肉组织中可能与胰岛素抵抗有关的miRNA以及这些miRNA影响胰岛素抵抗的可能机制，胰岛素抵抗与PCOS密切相关，甚至是部分患者的重要病因之一［14］。本研究显示miRNA-146a在PCOS患者血清中异常高表达，观察组患者睾酮、黄体生成素、雌激素、葡萄糖、胰岛素和催乳素的水平均显著高于对照组。另外，卵泡刺激素在观察组患者的水平则明显低于对照组人群中的浓度，且与睾酮呈现负相关的作用与其生理功能相符。目前已有的报道显示，卵巢早衰患者血浆miRNA-146a表达水平与健康女性相比异常升高，表明其过度表达可影响卵巢正常功能，并引起早衰的现象发生［15］。PCOS与卵巢早衰主要由内分泌紊乱引起，两种疾病均出现闭经等临床现象，同时PCOS患者治疗不及时有转向卵巢早衰的可能。以上研究结果表明，育龄期女性血清miRNA-146a水平升高可能与机体内分泌通路的紊乱相关，扰乱卵巢正常功能，进而导致睾酮等激素代谢异常，影响患者正常生育能力。由于血浆中的miRNA可抵抗核酸酶而稳定存在，并且更易检测，可用于PCOS非侵入性的生物标志物。目前为止，仅发现了少部分循环miRNA与PCOS相关，后续还需进一步寻找在PCOS中有变化的循环miRNA，从而为PCOS的诊断、治疗及预后评估提供新的方向。
总之，本研究发现PCOS患者miRNA-146a表达升高，且其与睾酮呈负相关的作用，在PCOS患者的疾病发展过程中起到重要的作用，可作为一种快速、方便和有效的诊断PCOS疾病的指标之一。
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