人类精子冷冻是生殖医学中的重要领域，精子的活动能力与男性生育力明显相关［1］，在人类精子保存工作中，冷冻保护剂的配制直接决定了复苏后精子的质量。多年来，科学家一直在探索，不断提高精子的复苏率。海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类。由两个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，在组织细胞、红细胞冻干保存、卵母细胞以及精子冷冻保存中成为近年的研究热点。Bucak等［2］对海藻糖、牛磺酸、半胱氨酸在公羊精液冷冻过程中氧化应激作用的研究发现，冷冻精子复苏后可获得满意的活动率。本文应用含葡萄糖和海藻糖的保护剂冷冻人类正常精液，以探讨不同保护剂对人类精子冷冻复苏后活动能力的影响。
对象和方法
1.对象:35例标本来自2014年3月—2014年12月山西省人类精子库捐精志愿者，供精者年龄22～40岁，平均年龄(23.8±3.3)岁，禁欲2～7 d，取精前清洗手及外生殖器，用手淫法将精液标本留在无菌器皿中。
按照《WHO人类精液检查与处理实验手册(第五版)》［3］，采用西班牙SCA计算机辅助精子分析系统(CASA)分析精子动力学参数，当前向运动精子≥60%、精子浓度≥ 60×106/ml、精液量≥2 ml且pH 7.0～7.8纳入实验。
2.试剂配制:对照组冷冻保护液按照《WHO人类精液检查与处理实验手册(第五版)》推荐的冷冻保护液配方。实验组在对照组冷冻保护液的基础上，按照50 mM、100 mM、150 mM的浓度添加 D-海藻糖(C12H22O11·2H2O，分子量 378.3，Sigma T5251)。
调节pH值至7.2，用微孔直径0.22μm的过滤器除菌后，分装于5 ml无菌管内-20℃冷冻备用。
3.精液的检测及冷冻复苏:手淫法取出的精液放置在37℃、CO2浓度为5%的培养箱中液化;标本检测达到入选标准后，充分混匀，平均分成四份，分别以1∶1体积比与四种冷冻保护液充分混匀，液氮熏蒸法进行冷冻。
24 h后置于37℃恒温水浴箱中10 min复苏。用计算机辅助精子分析系统(CASA)分析前向运动精子(PR)、非前向运动精子(NP)、不活动精子(IM)、精子浓度和精子运动参数，并计算复苏率。
4.统计学处理:采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，检测数据用均数±标准差表示，采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果
采样四种保护剂冷冻的精子，复苏后PR比例均能达到40%，复苏率均高于60%，均可以达到精子库冷冻精子的基本标准。
实验组中50 mM组和100 mM组在PR、NP和精子复苏率均明显高于对照组，差异有统计学意义;其中100 mM组PR和复苏率明显高于其他三组，100 mM组复苏后PR均值达到54.1%，复苏率达到86.0%，但与其他各组相比，100 mM组标准差也是最大的。对照组和实验组、实验组间冷冻复苏后精子浓度、IM指标比较，差异均没有统计学意义。见表1。
表1 冷冻复苏后精子活力比较(%)
注:与对照组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01
三个实验组精子在曲线运动(VCL)、直线运动(VSL)、平均路径速度(VAP)、精子头侧摆幅度(ALH)四项运动参数均高于对照组，各个实验组与对照组间比较，差异有统计学意义，其中以100 mM组运动参数最有优势，说明在同样的复苏效果，100 mM在运动参数的改善上更具优势，见表2。
表2 冷冻复苏后精子运动参数比较
注:与对照组比较，#P＜0.01
讨论
在人类辅助生殖技术中，精子的活动能力是能否受孕的重要因素，是衡量男性生育力的最重要指标。提高冷冻复苏后精子的活力，是男性生育力保存研究的重点，不断提高精子的冷冻复苏率是人类精子库研究人员的奋斗目标。
众多学者对精子冷冻保护剂做了大量研究［4-5］。冷冻保护剂按照添加甘油的多少分为三类，即单一甘油型、甘油复合型和无甘油型。国内人类精子库应用较多的是甘油复合型。在精子冷苏过程中，细胞内冰晶的形成及溶液效应是精子损伤的主要原因，甘油是一种渗透型保护剂，与精液混合后，能很快渗入精子细胞内，降低细胞内液冰点，减少冰晶的形成，达到保护精子膜的作用。但甘油对精子也存在毒性作用［6］。人们对甘油复合型保护剂的配方进行了大量的研究，为了将甘油毒性降到最低，且保证精子的复苏率，现在较通用的甘油浓度为5%～10%。
本文依据《WHO人类精液检查与处理实验手册(第五版)》推荐的冷冻保护液配方作为基准，采用7.5%的甘油浓度。分别添加不同浓度海藻糖，比较了这四种保护剂对精子冷冻复苏的影响。
海藻糖(Trehalose)是一种安全、可靠的天然糖类，1832年由Wiggers将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来［7］，《nature》曾在2000 年7 月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出:“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡”［8］。海藻糖是生物组织的非特异性天然保护剂，属于非渗透性低温保护剂，海藻糖对细胞、组织、器官的保护机制是研究的热点，但对其作用机制目前仍没达成共识。目前主要有以下三种假说，即(1)“水替代”假说;(2)“玻璃态”假说;(3)“优先排阻”假说。海藻糖可使动植物和微生物等有机体在冷冻、高温、脱水、高渗透压及有毒试剂等环境中仍然能保持生命活力［9］。
海藻糖在组织细胞、红细胞冻干保存、卵母细胞以及精子冷冻保存中成为近年的研究热点。Bucak等［2］对海藻糖、牛磺酸、半胱氨酸在公羊精液冷冻过程中氧化应激作用研究发现，冷冻保护液中添加100 mM海藻糖能够显著提高复苏精液的过氧化氢酶(对照组1 064 kU/l，海藻糖组738 kU/l)和维生素E(对照组3.9 mg/dl，海藻糖组4.7mg/dl)水平，精子活力和正常形态率均高于对照组。Shiva Shankar Reddy等［10］在牛精子冷冻保护液中添加海藻糖和牛磺酸的研究中显示二者可降低牛精子冷冻过程中的损伤，可以有效减少标本中的活性氧，认为最佳剂量为海藻糖100 mM，牛磺酸50 mM。Tuncer等［11］的研究发现，25 mM海藻糖和3 mM谷氨酰胺在牛精子冷冻过程中不能有效减少ROS，也不能明显提高精子活力。上述研究结果都来自动物，没有海藻糖用于人类精子慢速冷冻的数据支持。本实验在人类精液冷冻保护稀释液中添加一种单糖(葡萄糖)、一种双糖(海藻糖)，采用报道中效果较为明细的50～150 mM做为实验剂量，发现100 mM海藻糖能获得很好的运动参数，100 mM浓度的海藻糖能获得很好的复苏后精子活力，150 mM的海藻糖浓度不能起到很好的保护效果。
精子冷苏过程可致精子结构和功能发生改变，可引起精子头部胞膜广泛肿胀、破损，致使顶体膜脱落，内容物丢失，致使顶体膜的蛋白水解酶丢失或活性降低［12］。要提高精子复苏率，获得更高的精子活动力，必须尽可能保护细胞膜的完整性。葡萄糖和海藻糖都是小分子糖类，葡萄糖是单糖，可通过主动运输进入精子细胞，调节胞内外的渗透压，保持细胞内外等渗，起到对精子的保护作用。但葡萄糖在精子快速复苏过程中，不能迅速从细胞内移出，会对精子造成损伤。有研究认为双糖可以弥补单糖的不足［4］，双糖在细胞外发挥保护作用，不穿过细胞膜，可通过提高细胞外液的浓度，产生跨膜的渗透压梯度，使得水分精子细胞内渗出，引起精子细胞脱水，发挥非特异性保护作用。
实验结果显示用海藻糖配合葡萄糖作为冷冻保护剂不仅提高了冻存精子复苏率，同时也改善了精子复苏后的运动参数，提示海藻糖在冷冻过程中对精子功能保护效果比较明显。董云华等［13］认为，精子参数VSL、曲线运动VCL、平均路径速度VAP是反映精子活力的有效指标，与精子活力关系密切，与不育男性生育能力具有显著的相关性。张树山等［14］比较了冷冻保存液中添加不同水平海藻糖、蔗糖和乳糖对猪精液冷冻保护的效果。发现复苏后活力海藻糖和蔗糖组无差别，但是海藻糖组的有线粒体活性精子百分率和精子顶体完整率显著高于蔗糖、乳糖，海藻糖组，海藻糖组的精子获能率显著优于蔗糖、乳糖和对照组，也提示海藻糖对精子功能保护效果比较明显。
海藻糖与单糖、其他双糖等配合使用可以获得更好的冷冻保护效果。本实验采用与葡萄糖的配伍效果明显，Rosato等［15］报道，无论是慢速程序化冷冻还是快速玻璃化冷冻，在冷冻保护剂中添加胎牛血清与充足的蔗糖或海藻糖，都可以有效提高兔精子的冷冻复苏比例。Fabbrocini等［16］在4℃的环境中，分别使用7%二甲基亚砜、7%丙三醇、7%甲醇配伍0.04 mol/L海藻糖保存海胆精子，解冻后二甲基亚砜配伍海藻糖组的快速运动精子所占比例较其他两组显著升高。所以选择合适的配伍试剂可以发挥更大的冷冻保护作用。
关于海藻糖的保护作用机制，还有待进一步探索，Jiang等［17］认为海藻糖的生物保护作用是多种保护机制协同作用的结果。海藻糖可通过渗透调节作用抵御低渗透压、化学作用以及低氧等因素对细胞的影响，海藻糖可减轻甚至避免渗透性保护剂所导致的细胞过度肿胀和渗透性休克。
本实验提示添加50～100 mM的海藻糖配合葡萄糖可以有效的保护精子活力，可改善复苏精子的运动参数，海藻糖冷冻保护机制还有待将来进一步实验研究。
参考文献
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