在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌，其中发展中国家宫颈癌死亡率超过80%，在发展中国家，宫颈癌属于常见多发的妇科恶性肿瘤，我国每年新发病例约13.15万人［1］。因此，宫颈癌是严重威胁我国妇女健康的重大疾病。宫颈癌的发生是一个多因素过程且具有疾病遗传异质性的特点，全基因组分析将更有效地解释宫颈癌的复杂性。近年来，基因芯片大量应用于包括宫颈癌在内的各种妇科恶性肿瘤中，利用基因表达数据可以获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤相关基因的表达模式，为研究肿瘤发生发展中多基因改变的分子机制提供了有力的工具。本研究采用含有全基因组表达谱芯片检测5例宫颈癌组织基因差异表达谱，利用基因芯片对基因表达谱进行分析，有效筛选出新的宫颈癌相关基因。NF-κB在肿瘤发生、发展过程中的作用和相关性一直是近年来肿瘤研究的重点，本文选择运用real-time PCR和免疫组织化学的方法检测NF-κB在宫颈癌组织中的相对表达量和定位情况，初步探讨两者在宫颈癌发生、发展过程中作用，为进一步了解宫颈癌的发病机制提供依据，也为宫颈癌的治疗提供新的靶点。
资料与方法
1.临床资料:收集2014年6月至2015年3月活检及手术切除的新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织标本(均经病理证实为宫颈癌)和正常宫颈组织标本(因子宫肌瘤切除子宫)共79例。其中宫颈癌标本62例，正常宫颈标本17例(子宫肌瘤)作为阴性对照。收集的宫颈癌及正常宫颈组织标本详细登记后，均分两份，一份立即液氮速冻，-80℃冰箱保存，另一份用中性福尔马林液浸泡，送病理科。其中宫颈癌组织及正常宫颈组织各5例寄往北京博奥公司行基因芯片检测。宫颈癌患者年龄在27～65岁，中位年龄46岁。所有病例术前均未行放、化疗，按照世界抗癌组织(UICC)2009年宫颈癌TNM分期标准对全部病例进行统一命名和分类，其中Ⅰ期14例，Ⅱ期20例，Ⅲ期28例。患者入选标准为术前活检经病理证实诊断为宫颈癌;所有患者检查前没有接受化疗或放疗;所有患者既往无宫颈癌或其他恶性肿瘤病史。
2.全基因组表达谱分析:芯片采用北京博奥公司人类全基因组寡核苷酸芯片 Affymetrix GeneChip PrimeViewTM Human Gene Expression Array型号的基因芯片，共有20 000条70 met长度的寡核苷酸，每条寡核苷酸代表人的一个基因，核苷酸序列购自美国Qiagen公司。用以检测5例病例组(宫颈癌)和5例对照组的组织标本。对RMA算法预处理后的数据进行差异表达基因分析，即有3个及以上生物学重复的实验设计，利用(signifi-cance analysis of microarray)R程序包分析差异基因，差异基因的筛选标准是q-value≤5% 且Fold Change≥2或≤0.5;利用MAS软件分析差异基因功能状态;使用Cluster及TreeView软件，对5例宫颈癌和5例对照标本组织中的差异表达基因进行聚类分析。
采用Trizol一步法提取组织块中的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，并进一步采用 Nucleo-Spin RNA clean-up试剂盒 (MACHEREY-NAGEL，Germany) 对总RNA进行过柱纯化，测定浓度和OD260/280，并电泳检测RNA的完整性。RNA分光光度计进行RNA定量时，OD260/280在1.8～2.0之间，甲醛变性凝胶电泳28 S和18 S rRNA比值在2.0左右。
人类全基因组寡核苷酸芯片检测主要包括如下步骤。
(1)反转录合成 First strand cDNA:以 Total RNA起始，含有T7启动子序列 的T7 Oligo(dT)Primer为引物，使用 First Strand Enzyme Mix合成First strand cDNA。
(2)合成 Second strand DNA:用Second Strand Enzyme Mix将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为 Second Strand cDNA，合成双链DNA。
(3)体外转录合成 cRNA:以 Second Strand cDNA为模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，掺入生物素biotin。
(4)cRNA纯化:使用磁珠纯化cRNA，除去盐、酶等杂质，并cRNA进行定量。
(5)cRNA片段化:将cRNA片段化成适宜杂交的大小。
(6)芯片杂交、清洗、扫描:芯片杂交、清洗扫描，甩干后用40μm的Cy3通道扫描，扫描时间由芯片类型不同而异，一般在5～15 min。
(7)获得芯片杂交图。
3.实时荧光定量检测:所用的引物及内参照GAPDH引物均委托上海生工公司合成(表1)。采集后迅速放至液氮中冷冻，-80℃保存，使用Trizol RNA提取液，按照Promega说明书对宫颈癌组织和正常宫颈组织提取总RNA，通过甲醛变性凝胶电泳定性和紫外分光光度仪定量，取总RNA 1μg，进行逆转录，按照说明书进行。DNA合成，所得cDNA置于-20℃保存。采用SYBER Green嵌合发光法，荧光定量PCR仪(ABI7500)扩增目的基因和内参基因，PCR 反应体系为 25 μl，10 ×PCR Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，10 nmol/L Primer 1 μl，1 nmol/L Probe 2.5 μl，5 μl/L Taq 0.25 μl，cDNA 2.5 μl，无菌蒸馏水 15 μl，反应条件为 94℃变性5 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃30 s，共40个循环，循环结束后72℃延伸10 min，所有反应均设3个复孔。绘制溶解曲线，采用比较阈值法对实时定量real-time PCR结果进行定量分析。
4.免疫组化方法:采用 EnvisionTM二步法，10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片(厚度4μm)，常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶，高温高压修复抗原，其余步骤按试剂盒说明操作，PBS代替一抗作为阴性对照。
5.引物的设计:引物依照GenBank检索的目的基因序列由上海生工生物工程公司合成。见表1。
表1 引物序列
6.试 剂:逆转录试剂盒(德国DBI公司)、RNA提取试剂盒(Promega)、琼脂糖(美国 Sigma公司)、PCR引物(上海生工公司合成)、DBI-2220实时荧光定量试剂盒(德国DBI公司)、EnvisionTM二步法免疫组化试剂盒(丹麦DAKO公司)、EnvisionTM二步法试剂盒(二抗)(丹麦DAKO公司)，DAB显色剂(丹麦DAKO公司)，兔抗人NF-κB多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)。
7.免疫组化结果判定:免疫组化染色在资深病理科医师指导下进行分析判断，以细胞浆染成黄色或棕褐色为阳性。选择5个以上高倍视野，计数不少于500个细胞。根据染色显色强度及阳性细胞比例相结合法进行分析评定，即(1)根据着色深浅评分。无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;(2)着色细胞占计数细胞百分率，≤5%为 0分，6% ～20%为1分，21% ～50%为2分，≥51%为3分;(3)染色分值判断，阳性细胞着色深浅分值为(1)与(2)的乘积，乘积结果0分为阴性，1～3分为+，4～6分为++，9分为+++。
8.统计学处理:实时荧光定量采用相对定量CT值比较法检验基因的表达变化，行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布、方差齐性，单变量两组资料间用t检验，多组比较用单因素方差分析。临床资料中计数资料比较应用χ2检验，所得数据均用SPSS17.0统计软件分析处理，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
结果
1.新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织与正常宫颈组织共同差异表达基因的聚类分析结果:对基因芯片检测的5例宫颈癌组织及5例正常宫颈组织标本中存在显著变化的基因进行分层聚类分析，其中横排为差异表达基因，纵列为不同患者。前5列为A组(对照组)，后5列为B组(宫颈癌组)，红色为上调基因，绿色为下调基因，黑色表示表达无变化，宫颈癌组织与正常宫颈组织中基因表达存在着明显的聚类性质不同，宫颈癌组织中以NF-κB表达上调最为明显(图1)。
2.NF-κB mRNA的表达结果:凝胶电泳结果显示NF-κB mRNA在208 bp处可见清晰的条带，GAPDH mRNA在496 bp处可见内参条带。宫颈癌条带的亮度明显优于正常宫颈条带。统计学结果显示，宫颈癌组中NF-κB mRNA的相对表达量均明显高于正常宫颈组，差异有统计学意义。见表2、图2。
表2 NF-κB mRNA在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达
注:与正常宫颈组织比较，*P＜0.05
3.NF-κB蛋白的表达结果:NF-κB在宫颈癌组织的细胞核和细胞质均有表达，强度呈现淡黄色、黄色。NF-κB蛋白在宫颈癌组和正常宫颈组中阳性表达率分别为51.61%和11.76%(2/17)，差异有统计学意义。见表3、图3。
表3 NF-κB在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达
注:与正常宫颈组织比较，*P＜0.05
4.NF-κB蛋白在不同病理和临床分期旳宫颈癌组织中的表达情况:NF-κB蛋白在宫颈癌组织中高分化、中分化、低分化组的阳性表达率比较，三组之间差异有统计学意义;其中高分化与低分化组比较差异有统计学意义，高分化与中分化差异有统计学意义，中分化组与低分化组差异无统计学意义。NF-κB蛋白在宫颈癌临床分期的阳性表达率比较，三者之间差异有统计学意义;其中 I+II期与III期比较差异有统计学意义，I+II期与IV期差异有统计学意义，III期与IV期差异无统计学意义。有淋巴结转移组与无淋巴结转移组比较，差异有统计学意义。NF-κB蛋白的阳性表达与年龄无关，差异无统计学意义。见表4。
表4 NF-κB蛋白在宫颈癌组织中的表达与临床病理资料的关系
注:*P＜0.05;与低分化组比较，aP＜0.05;与中分化组比较，bP＜0.05;与III期比较，cP＜0.05;与IV期比较，dP＜0.05
讨论
NF-κB作为调节炎症反应的一个重要因素，在肿瘤的研究中发现，NF-κB通过不同的途径参与了肿瘤的发生、发展、浸润和转移的过程，并在其过程中发挥了重要的作用。
NF-κB及其相关蛋白组成一个结构相关的转录因子家族，这些转录因子的持续激活也在许多疾病过程中发挥作用，如，肿瘤、关节炎、慢性炎症、哮喘、神经退行性疾病和心脏病［2］。哺乳动物NF-κB家族蛋白由五个成员组成，可以分成两个亚类，即“NF-κB”和“Rel”。这些蛋白拥有一个高度保守的DNA结合与二聚体化的功能结构域，称作Rel同源结构域(Rel homology domain，RHD)［3］。NF-κB 转录因子二聚体可以结合特异的9～10 bp的DNA序列，称作 κB位点。κB位点具有很强的可变性(5'-GGGRNWYYCC-3')［4］，很多基因的转录调控区都包含有该位点，受到这个转录因子的调控。另外，NF-κB的激活还受转录水平的调节。现阶段研究较为明确的信号传导通路包括TNF-R1-TRADD-RIP通路;IL-lR-IL-lRAcP/MyD88-IRAK＞IRAK2-TRAF6通路;P13K-Akt通路。大量的细胞因子、致癌剂和肿瘤微环境都能通过相应的信号通路活化NF-κB，从而调控下游蛋白的表达，参与肿瘤的发生、进展、侵袭和转移。越来越多的研究文献表明［5-7］，在多种恶性肿瘤组织中均有NF-κB过表达。
Beg等［8］通过实验观察到HBVX蛋白可以激活NF-κB，使其从胞浆移位与胞核内发挥作用，进一步将外源性HBVX基因转染肝癌细胞，表明HBVX蛋白对NF-κB的活化可能促进了肝癌的发生。本实验采用real-time PCR方法检测了12例宫颈癌、10例正常宫颈中NF-κB mRNA和蛋白的表达情况，结果显示宫颈癌组织中NF-κB mRNA相对表达量为(0.668±0.045)，明显高于宫颈病变组(0.473±0.032)，差异有统计学意义;免疫组织化学结果显示，NF-κB蛋白阳性表达率为51.61%，明显高于宫颈病变组阳性表达率(11.76%)，差异有统计学意义。本实验结果发现，NF-κB基因和蛋白在宫颈癌组织中的表达水平均高于正常宫颈组织，与Rodríguez-Berriguete 等［9］研究结果相一致。提示NF-κB高表达在宫颈癌的发生发展过程中是一个早期事件，活化的 NF-κB通过与特定的靶基因相结合，调控下游相关基因的表达，促进了前列腺组织细胞的增殖、转化、恶变。从而验证了NF-κB可能作为新的宫颈癌治疗的靶点。通过分析宫颈癌组织中NF-κB蛋白的表达和不同病理分级之间的关系，本文实验发现，高分化组阳性表达率为31.25%，中分化组阳性表达率为64.00%，低分化组阳性表达率85.71%，三者比较差异有统计学意义;组间两两比较，发现中分化与低分化组差异无统计学意义。本实验结果提示，宫颈癌组织的分化程度越差，恶性程度越高，NF-κB蛋白的表达水平越高。本实验进行了宫颈癌组织中NF-κB蛋白的表达和不同临床分级的关系的研究，结果显示，I+II期、III期、IV期宫颈癌中 NF-κB的阳性表达率依次为 21.43%、65.00%和82.14%，差异有统计学意义;各组之间的两两比较发现，III、IV期差异无统计学意义。本实验结果表明，III、IV期宫颈癌组织中NF-κB蛋白的阳性表达水平明显高于I+II期，提示浸润性宫颈癌组织中的NF-κB蛋白表达明显高于局限性宫颈癌，尤其在有淋巴转移和骨转移的病例中，NF-κB蛋白阳性表达率更高。Mimeault等［10］研究发现，在宫颈癌组织中NF-κB呈过度表达水平，并随着临床分期的增高，表达愈高。提示NF-κB可以作为评估宫颈癌生物学特性的一个指标。
年龄作为宫颈癌发生的一个独立的因素，虽然老年人宫颈癌的患病率高于青年人，但是本研究以65岁为界，GAPDH结果提示，年龄大于65岁患者NF-κB的阳性表达率为72.73%，高于年龄小于65岁患者阳性表达率(51.72%)，但两者差异无统计学意义。
本研究结果显示，在宫颈癌中 NF-κB呈高表达，促进了宫颈癌细胞的增殖和转移。因此，NF-κB可能候选宫颈癌治疗的分子靶标，特别是适当的抑制剂阻断NF-κB可能对妇女宫颈癌的治疗是有效的。
(图1、图2、图3)
NF-κB在新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中的表达及临床意义( 正文)
图1 维吾尔族宫颈癌与正常宫颈组织不同基因表达聚类分析
图2 NF-κB mRNA在宫颈癌组织中的表达
图3 NF-κB在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达
参考文献
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