多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是青春期及育龄期女性中最常见的具有高度异质性伴有糖代谢异常的内分泌及代谢紊乱性疾病，是引发无排卵性不孕的主要原因，其具体病因尚未阐明［1］。有研究表明，卵泡的发育受阻及优势卵泡的选择与颗粒细胞凋亡有关［1］。骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP7）作为转化生长因子β（TGFβ）超家族中的一员，在胚胎发育及再生修复中起重要作用，但BMP7的异常表达是否与颗粒细胞凋亡及进而引发卵泡发育受阻和优势卵泡选择闭锁相关，目前尚未见报道［2］。本研究通过比较PCOS与正常排卵患者颗粒细胞凋亡情况及BMP7的表达差异，初步探讨PCOS患者体内BMP7的异常表达对颗粒细胞增殖的影响，为改善临床PCOS患者的卵泡发育及妊娠率提供理论依据。
对象与方法
一、对象
选择2015年9月—2016年1月于本中心行体外受精胚胎移植技术（IVF ET）或卵泡质内单精子显微注射（ICSI）助孕治疗的患者44例，年龄22～37岁，平均（28．9±3．1）岁。符合 2003年荷兰鹿特丹会议上制定的PCOS诊断标准的PCOS组33例；无排卵功能障碍，因输卵管因素或男性不育接受IVF／ICSI治疗的对照组11例。排除标准：患者近3个月受过促排卵治疗或服用过促排卵治疗；患者合并有子宫内膜异位症、库欣综合征、肾上腺肿瘤、卵巢功能早衰及卵巢男性化肿瘤等。本研究已由山西省妇幼保健院（儿童）医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。
二、方法
1．卵巢刺激方案：本研究中PCOS患者于治疗周期前部分口服避孕药达英35或炔雌醇环丙孕酮片。所有患者均采用拮抗剂方案，患者从月经周期第2天或口服避孕药、孕激素撤退出血第2天，通过阴道B超及血激素水平评估卵巢基础状态，于月经第2～3天开始启动促排卵，从启动日起使用FSH（普利康，美国默沙东公司或丽申宝，珠海丽珠制药公司）及人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotrophin，hMG）（珠海丽珠制药公司）进行促排卵，启动剂量根据患者年龄、体重指数（body mass index，BMI）、基础 FSH水平、窦卵泡计数等而定。在Gn应用4～5天后阴道B超监测卵泡生长情况，根据卵泡生长及血激素水平，及时调整促排卵药物剂量。在优势卵泡直径＞14 mm时开始注射GnRH拮抗剂（加尼瑞克，美国默沙东公司）0．25 mg／d。当有3枚以上卵泡直径≥18 mm时，于当晚给予人绒毛膜促性腺激素（hCG，珠海丽珠制药公司）5 000～10 000 U肌肉注射，注射hCG后36～38 h行超声引导下经阴道穿刺取卵术。其余操作按照本中心的常规进行。
2．体外受精胚胎移植和黄体支持治疗：两组均在hCG注射后36～38 h后经阴道B超引导下行取卵术，取卵日开始进行黄体支持（注射用黄体酮40 mg／d）。根据患者病情行常规受精或单精子卵胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），16～18 h后观察受精情况，授精后18～20 h观察，有清晰双原核者（2PN）为受精卵。在取卵后第3天进行可用胚胎评估并移植，可用胚胎为受精第3天卵裂球4～8个，分级为2级及以上的胚胎，取卵后3 d或5 d行ET术。
3．卵泡液及颗粒细胞的收集：于患者取卵当天，收集PCOS及对照组妇女未经血液污染的卵泡液，经4 000 r／min离心25 min，将上清液收集便为分析用卵泡液，且将其封存于 15 ml离心管内，于－80℃冰箱冻存备用。用PBS将卵泡液离心后的沉淀清洗3次，用PBS（1 m l）将其混匀，随后用吸管将其吸取且加入具有等体积的淋巴细胞分享液中，于2 500 r／min条件下离心20 min，将第2层颗粒细胞（白色云雾状细胞团）收集于离心管内，且用PBS将其清洗3次后于－80℃冰箱冻存备用，用于相关指标检测。
4．Real time PCR：检测膜受体 BMP7、Bcl2及Caspase3 mRNA转录水平。用PBS将收集的卵丘颗粒细胞洗涤3次，采用 RNA提取试剂盒（TIANGEN，天根生化科技有限公司）提取细胞总RNA进行逆转录，采用Real time PCR对逆转录的cDNA进行PCR扩增。以GAPDH，进而优化反应条件，使目的基因与内参的扩增效率接近100%，Ct值代表基因的起始拷贝数，可根据Ct值比较基因的表达量。ΔΔCt＝（Ct目的基因Ct内参基因）（Ct阴性对照Ct内参基因），以2ΔΔCt计算各组 mRNA的相对表达量。基因引物序列如下：BMP7上游 5′CTCCAAGACGCCCAAGAACCAGG3′， 下 游 5′GCTGTCATCGAAGTAGAG GACGGA3′；Bcl2上游5′GGTGGGGTCATGTGTGTGG3′， 下 游 5′CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC3′；Caspase3上 游5′CATGGAAGCGAATCAATGGACT3′， 下 游 5′CTGTACCAGACCGAGATG TCA3′；GAPDH上游 5′ATGGGCAGCCGTTAGGAAAGC3′， 下 游 5′CCTGGAAGATGGTGATGGGATT3′，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。
5．Western blotting检测卵巢颗粒细胞中BMP7的蛋白表达水平：取4μl蛋白上样缓冲液与20μl卵泡液混合，于100℃水中煮沸10 min。随后采用SDS PAGE胶对颗粒细胞中的蛋白进行电泳分离，采用半干转膜，用5%的牛奶封闭液对PVDF膜进行封闭 1 h，随后加入 BMP7的多克隆一抗（Proteintech公司）于4℃摇床孵育过夜。辣根过氧化物酶标二抗（康为世纪）孵育2 h后，加入化学发光剂曝光。各组以βactin为研究内参，比较各组卵泡液中蛋白的相对表达水平。
6．流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡率：用PBS将颗粒细胞洗涤3次后，将颗粒细胞悬液的深度调整到1×106个／m l，随后取1 ml颗粒细胞悬液经1 000 r／min离心10 min，去PBS后垂直加入预冷的70%乙醇中固定1～2 h。经离心将固定液弃去，于3 ml PBS中重悬 5 min，再经 1 000 r／min离心5 min，弃去 PBS，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI，100μg／ml）于4℃避光 30 min上机。于 PI荧光的直方图上，凋亡细胞于G1／G0期会出现一个亚二倍体峰，其所占样本数的比例即为颗粒细胞凋亡率。
7．统计学处理：采用SPSS 170统计软件进行统计学分析。计量资料用（珋x±s）表示，两组间比较采用t检验。计数资料用率（%）表示，采用χ2检验。p＜005为差异有统计学意义。
结 果
一、两组一般参数及用药情况比较
两组腰臀比（waist hip ratio，WHR）及超排天数比较，差异无统计学意义；PCOS组年龄、FSH及Gn用量均低于对照组，而BMI、LH、E2、T值均高于对照组，差异均有统计学意义，见表1。
表1 两组一般参数及用药比较
注：两组比较，p＜0．05
二、两组间颗粒细胞凋亡情况
两组卵丘颗粒细胞固定后于流式细胞仪上检测其凋亡率，PCOS患者颗粒细胞凋亡细胞的DNA含量为（3．51±0．23）显著高于对照组（1．32±0．09），差异有统计学意义（图1）。
图1 两组间颗粒细胞凋亡情况
三、两组 BMP7、Bcl2及 Caspase3 mRNA转录水平
PCOS组卵丘颗粒细胞内Bcl2转录水平显著降低对照组，Caspase3转录水平高与对照组，差异均有统计学意义；BMP7 mRNA转录水平略低与对照组，但差异无统计学意义，见表2和图2。
表2 两组BMP7、Bcl2及Caspase3 mRNA转录水平比较
图2 两组 BMP7、Bcl2及 Caspase3mRNA转录水平
四、两组颗粒细胞内BMP7蛋白的表达情况
PCOS组颗粒细胞内 BMP7表达为（036±004），低于对照组（079±017），差异有统计学意义，见图3。
图3 两组卵泡液中卵源性蛋白BPM7的表达情况
讨 论
PCOS是育龄期女性最常见的内分泌紊乱性疾病，临床主要表现为持续无排卵、高雄激素血症及B超下卵巢呈多囊样改变，其病理生理特点主要表现为卵泡发育障碍，然而迄今为止其病因及具体发病机制尚未探明［3］。目前认为，PCOS患者卵泡发育障碍可能是异常内分泌及旁分泌因子、代谢障碍及卵泡内微环境改变共同作用的结果。其中卵泡内微环境是影响卵母细胞的质量及卵裂能力的关键因素之一，可通过自分泌及旁分泌形式产生的局部调节因子构建一个不断变化而又相对稳定的微环境，进而影响卵泡的生长发育，在PCOS的发生、发展过程中发挥重要作用。同时有研究表明，TGFβ超家族成员BMP7可通过旁分泌和自分泌的方式影响卵泡发育及促进颗粒细胞生长成熟、减缓颗粒细胞凋亡，抑制孕酮分泌等［4］。因此，对本中心IVF／ICSI助孕治疗的女性患者取卵当天颗粒细胞中BMP7进行了检测，发现PCOS患者的颗粒细胞BMP7蛋白表达水平较对照组降低而mRNA与对照组无差异，因此，推测BMP7的异常改变可能不是由转录水平引起。BMP7不仅是卵泡生成过程中重要的调控因子，且可通过旁分泌及自分泌作用参与卵丘扩展，对于维持卵母细胞的最佳微环境及正常排卵、受精具有重要意义。
有研究表明，延迟成熟的卵母细胞与颗粒细胞的凋亡密切相关，且可对胚胎的发育潜能造成影响［5］。PCOS患者双侧卵巢存在大量小窦卵泡，然而其无法周期性形成成熟卵泡，进而卵泡发育停滞，无优势卵泡排出，其机制可能与细胞凋亡调控异常相关［6］。Bcl2在细胞的凋亡进程中发挥着关键作用，其主要通过阻止线粒体内Ca2＋与细胞色素C的释放作用，来发挥抗氧化作用进而抑制细胞的凋亡。Caspase3主要通过破坏DNA修复及操作基因整性来引发细胞凋亡，且该进程会被 Bcl2阻断［7］。同时有文献报导，BMP7可通过抑制Caspase3及上调Bcl2的表达来抑制线粒体凋亡途径，进而对损伤组织细胞起到保护作用［8］。然而，PCOS患者体内BMP7的异常表达是否与其体内凋亡相关因子的紊乱相关，目前较少研究。本研究通过对颗粒细胞凋亡率的检测发现，PCOS患者的凋亡率较对照组显著增高，且凋亡相关基因Bcl2表达下调而Caspase3表达显著增高。同时，另有研究报道，BMP7能刺激大鼠颗粒细胞内DNA的合成，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的释放以减缓颗粒细胞凋亡［9］。由此可以推断，在PCOS患者体内存在BMP7信号通路的异常，而此通路的异常可能与颗粒细胞增殖存在一定的相关性。
综上所述，BMP7可于人的卵丘颗粒细胞中检测到，且于PCOS患者卵泡液中表达量显著降低，BMP7的异常表达可能是引发PCOS患者卵母细胞成熟障碍及胚胎发育潜能降低的重要因素。同时验证了PCOS患者颗粒细胞凋亡率的增加及凋亡调控蛋白的异常改变，说明BMP7的异常改变与PCOS的发病有一定的关系，且参与了卵巢颗粒细胞的凋亡过程，但要确切知道引发BMP7蛋白水平改变的原因需从表观遗传学角度进一步进行研究。
参考文献
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8 Liapis H．Biology of congenital obstructive nephropathy．Nephron Exp Nephrol，2003，93：e8791．
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