多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS) 是育龄期妇女常见的内分泌紊乱性疾病，患病率约为 6%～10%，主要的临床表现包括月经稀发或闭经、慢性无排卵、不孕、多毛及痤疮等，还可出现稀发排卵或无排卵、胰岛素或高雄激素抵抗、多囊卵巢为特征等内分泌征候群[1]。临床上，经阴道彩色多普勒超声是PCOS不孕患者检查的必备手段，对评价子宫内膜的容受性具有重要意义。文献[2]将PCOS患者的子宫内膜分为三型，即A型、B型和C型，其中A型为低回声三线型，B型为均质中等回声，C型为强回声；A型子宫内膜较B型和C型受精卵着床率高，且卵泡期子宫内膜出现高回声预示不良的妊娠结局。本研究的主要目的是用经阴道彩色多普勒超声对PCOS患者的子宫内膜超声分型，同时取内膜组织活检进行组织学染色和免疫学检测，并结合血清相关激素水平，来评价三者之间的关系，为后续PCOS患者检查的选择和病情的评估提供临床依据。
对象与方法
一、对象
研究对象为2014年6月—2016年4月于本院生殖中心就诊的PCOS无排卵患者75例(PCOS组)和健康体检者33例(对照组)。PCOS组患者年龄20～39岁，平均(28.0±4.0)岁，均已婚。所有研究对象中，停经天数10～13 d者5例，14～19 d者16例，20～89 d者41例，≥90 d者13例。所有研究对象近期均无激素类药物应用史，PCOS的诊断主要参考中华医学会和美国内分泌学会发布最新诊治指南[3]。对照组年龄21～40岁，平均(30.0土5.0)岁，均已婚，排卵前22例，排卵后11例。两组研究对象在年龄、婚姻状况基线资料上差异无统计学意义，具有可比性。
二、研究方法及观察指标
根据实验设计，主要对两组患者的超声形态学分型、组织学分期以及血清激素水平进行观察和比较。
1.子宫内膜超声形态学分型的观察：主要使用彩色多普勒超声诊断仪(频率范围2.0 ～10.0 MHz，江苏徐州大为B超厂)进行检查，选择经阴道探头对两组患者进行盆腔超声波扫描检查，检查子宫冠状面的前壁和后壁，测量子宫内膜至肌层交界处之间的距离，即子宫内膜的厚度。子宫内膜的超声形态学分型主要参考Gonen等的超声分型标准[4]，A型为低回声三线型，B型为均质中等回声，C型为强回声。
2.子宫内膜组织形态学观察：运用经阴道彩色多普勒超声观察两组患者卵巢卵泡和子宫内膜生长情况，于卵泡生长中晚期取对照组子宫内膜组织进行检查，PCOS组于停经后的不同阶段取内膜组织进行检查，分别留取2份组织，1份用于常规HE染色，1份运用SP法(链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法，又称LAB法)检测内膜组织Ki67和降钙素(calcitonin)表达情况，这两种物质皆特异性表达于分泌中晚期。一抗分别为鼠抗人Ki67单克隆抗体和兔抗人降钙素多克隆抗体(深圳市科润达生物工程有限公司)。Ki67阳性细胞可于细胞核内见到棕黄色颗粒，最终结果以百分率表示；calcitonin阳性细胞可于细胞质内见到棕黄色颗粒，图像使用THEMIS高光谱图像分析系统(上海悌可光电科技有限公司)进行分析。
3.血清激素水平的检测：对照组于月经周期第2～5天，PCOS组于停经后抽取外周血，检测FSH、LH、孕酮、雌二醇、催乳素及睾酮等的水平。组织活检后再次抽取外周血进行检测。
4. 统计学处理：所有数据运用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验和Fisher检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、PCOS患者子宫内膜超声形态学分型
75例PCOS患者中，子宫内膜A型为24例，B型为33例，C型为18例。PCOS患者中停经天数为20～89 d有41例，停经≥90 d的患者子宫内膜分型全部为B型或C型。PCOS患者不同子宫内膜超声形态学分型比较，差异有统计学意义。见表1。
表1不同停经时间的PCOS患者子宫内膜超声形态学分型
注：A、B、C型的合计比较，*P<0.05
二、PCOS患者子宫内膜组织分期及激素水平
75例PCOS患者中，62例患者子宫内膜处于增生期，其中 6例表现为增殖症；13例患者子宫内膜处于分泌期，且均表现不同程度的分泌不良。不同停经时间患者的子宫内膜组织分期比较，差异无统计学意义。62例增生期患者子宫内膜组织活检当日孕酮为(1.5±1.8) nmol/L，LH为(16.0±6.0)U/L，雌二醇为(257.0±129.0)pmol/L；13例分泌期患者子宫内膜组织活检当日孕酮为(2.5±1.9)nmol/L，LH为(17.0±6.0)U/L，雌二醇为(313.0±69.0)pmol/L，增生期和分泌期患者的孕酮、雌二醇相比，差异无统计学意义。见表2。
表2不同停经时间的PCOS患者子宫内膜组织学分期状况
三、 两组研究对象子宫内膜超声形态学分型和组织学分期的对应关系比较
PCOS组患者中，24例患者子宫内膜为A型，51例为非A型(即B型或C型)。在A型患者中，3例患者出现局部梭形细胞增多的现象，即出现局灶性致密的间质异常情况，间质异常率为13.0%(3/23)；在非A型患者中，21例表现为间质异常，间质异常率为40.4%(21/52)；A型、非A型患者间质异常率比较，差异有统计学意义。PCOS组患者子宫内膜超声形态学分型与组织学分期的对比研究显示两者无明显的相关关系。对照组子宫内膜排卵前以A型为主，排卵后以非A型为主，其子宫内膜的超声图像表现为回声逐渐增强的现象；A型与非A型比较，差异不明显，无统计学意义。见表3。
表3两组患者超声形态学分型与组织学分期状况
四、 两组患者子宫内膜Ki67及Calcitonin的表达情况
两组患者子宫内膜增生期和分泌期Ki67表达皆出现阳性，PCOS组增生期Ki67阳性表达率为(31.0±12.0)%，分泌期为(16.0±7.0)%，两者相比，差异有统计学意义。对照组增生期为(35.0±11.0)%，分泌期为(10.0±6.0)%，两者相比，差异有统计学意义。PCOS组与对照组分泌期Ki67表达相比，差异有统计学意义。两组患者子宫内膜增生期无Calcitonin表达，分泌早期开始表达Calcitonin，PCOS组为(7.3±2.0)ng/ml，对照组为(8.1±1.5)ng/ml，两者差异无统计学意义。见表4。
表4两组患者Ki67及Calcitonin的表达情况比较
注：同组增生期与分泌期相比，#P<0.05；与对照组分泌期相比，*P<0.05
讨 论
根据文献中B超分型标准[5]，A型为三线型内膜，外层和中央为强回声线，外层和宫腔中线间为低回声区或暗区，常见于子宫内膜增生早期(即月经第6～10天)，此时内膜厚度4～9 mm；B型内膜为均一的中等强度回声，宫腔强回声中线断续不清。常见于内膜增生晚期(即月经第11天～排卵)，排卵时内膜厚度约9～12 mm；C型内膜为均质强回声，无宫腔中线回声，此时“三线征”消失，常见于黄体期(即排卵后～下次月经来潮前)，厚度约10～14 mm[3-4]。正常情况想下内膜厚度至少达到9 mm以上，才有利于受精卵的着床[7]。本研究中，PCOS患者中，63例患者子宫内膜处于增生期，其中6例表现为增殖症；13例患者子宫内膜处于分泌期，且均表现不同程度的分泌不良；PCOS患者排卵前以A型为主，排卵后以B型或C型为主，且均出现内膜组织局灶性致密等间质异常情况，A型间质异常率为13.0%，非A型间质异常率为40.4%，两者比较，差异有统计学意义。表明排卵后子宫内膜出现间质异常的情况明显高于排卵前，这可能与排卵后相关激素水平的变化密切相关。相关研究表明[6]，PCOS 组血清睾酮、促黄体生成素、泌乳素、LH/FSH 比值、空腹 FINS、胰岛素抵抗程度(HOMA-IR)、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)均显著高于对照组，并且肥胖PCOS组患者明显高于非肥胖PCOS组患者，96.3% PCOS 患者卵巢超声提示多囊样改变；而排卵后体内孕酮、雌二醇、FSH、LH等激素的变化以及胰岛素水平抵抗、炎症反应等的加重是导致排卵后子宫内膜间质异常的重要原因。
细胞的过度增生不但受细胞凋亡的影响，还受细胞增殖的影响。Ki67是一种细胞核相关抗原，为增殖性细胞核的标记物，分布于细胞核，是一种表达于非G0期和G1期的特异性非组化蛋白，参与细胞的合成代谢，在增殖的细胞中表达较多。子宫内膜Ki67的表达水平随卵巢激素的变化而出现周期性的变化，主要表达于增生期子宫内膜中，分泌期表达量明显减少。Calcitonin是甲状腺滤泡旁 C细胞合成、分泌的含32个氨基酸残基的肽类激素，子宫也能合成部分Calcitonin[7]。Calcitonin的主要作用是促进子宫内膜蜕膜化，Calcitonin还可对间质细胞外的Ca2+进行调节，抑制Ca2+内流，松弛上皮细胞之间的紧密连接，辅助胚胎着床。研究表明，Calcitonin的表达与子宫内膜“着床窗”的开放相吻合，对胚胎着床有重要意义[8-9]。用基因表达筛选技术的方法筛选“着床窗口期”子宫内膜基因表达情况，结果表明Calcitonin基因为主要之一，其表达与“着床窗”高度一致，且受母体孕激素调控，阻断表达将导致着床失败[10]。人类的胚胎着床发生于月经周期的分泌中期，此期子宫内膜较厚，有利于受精卵的着床；同时Calcitonin表达量较高，舒张宫腔血管，形成重要的辅助条件。而临床上采取促排卵的方法治疗PCOS患者，由于降低了Calcitonin表达量而影响子宫内膜容受性，导致胚胎与子宫内膜的黏附下降，结果胚胎着床失败；在促排卵治疗的基础上外加激素干预治疗，维持体内激素水平的稳定有利于受精卵的成功着床。这表明Calcitonin的表达可能受母体激素水平的调控，同时能反过来作用于子宫内膜调节受精卵着床[11]。本研究表明，PCOS组和正常对照组患者增生期Ki67阳性表达率均高于分泌期，且PCOS组增生期高于正常对照组分泌期Ki67阳性表达率，差异有统计学意义；两组患者子宫内膜增生期均无Calcitonin表达，分泌早期开始表达Calcitonin，PCOS组为(7.3±2.0)ng/ml，对照组为(8.1±1.5)ng/ml，两者差异无统计学意义。PCOS组患者由于分泌期Ki67阳性表达率和Calcitonin表达比正常患者低，因此，子宫内膜的着床条件差，不利于受精卵着床，这可能就是导致不孕的重要原因。
综上所述，PCOS组患者子宫内膜经阴道彩色多普勒超声呈强回声，内膜形态学表现为增生和分泌的异常，可能与PCOS患者子宫内膜间质发生组织学改变密切相关，也可能是导致不孕的重要原因。
参考文献
1 马丹.阴道彩色多普勒超声诊断多囊卵巢综合征的临床分析.基层医学论坛,2016,20:1026-1027.
2 范丽珍.育龄期多囊卵巢综合征患者卵巢超声影像学特征分析.黑龙江医药科学,2016,39:141-142.
3 何玉梅,宁荣萍,陈红坚.彩色多普勒超声在多囊卵巢综合征诊断中的应用价值.医学影像学杂志,2015,25 :2072-2075.
4 Gonen Y,Casper RF.Prediction of implantation by the sonographic appearance of the endometrium during controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization.J In Vitro Fert Embryo Transf,1990,7:146-152.
5 梁丽,马苏美.经直肠彩色多普勒超声对未婚女性多囊卵巢综合征的价值探讨.实用妇科内分泌电子杂志,2015,2:7-8.
6 杨丽娟,李洁,王玫,等.不同促排卵方案对多囊卵巢综合征患者子宫及卵巢血流的影响.中国现代医学杂志,2015,25:76-81.
7 Ságodi L,Barkai L.Diagnostic difficulties of polycystic ovarian syndrome in adolescent girls.Orv Hetil,2013,154:136-142.
8 Dewailly D,Pigny P,Soudan B,et al.Reconciling the definitions of polycystic ovary syndrome:the ovarian follicle number and serum anti-Müllerian hormone concentrations aggregate with the markers of hyperandrogenism.J Clin Endocrinol Metab,2010,95:4399-4405.
9 彭雪芳,余卫国,王蕾,等.阴式探头经直肠超声在诊断未婚女性多囊卵巢综合征中的应用价值 .临床和实验医学杂志,2012，11:1384-1385.
10 梁竹巍,王蕊,李春霞,等.多囊卵巢综合征子宫内膜生存素和Ki67的表达及临床特征研究.中国妇幼保健,2009,17:2414-2416.
11 王汝琴,陈倩,陈晓军,等.炎症标志物血清降钙素原和超敏C反应蛋白与多囊卵巢综合征相关因素研究.生殖医学杂志,2015,24:357-362.