双酚A(Bisphenol A,BPA)学名2,2-二(4-羟基苯基)丙烷，是近几年广受关注的一种环境内分泌干扰物，其具有弱雌激素活性，可以对人类健康产生复杂的影响，可涉及到全身多个器官，特别是生殖系统。以往对BPA生殖毒性的研究多着眼于其弱雌激素效应[1-3]，对卵泡发育及卵巢功能影响的报道偏少。近期研究表明，女性卵巢储备功能下降与血尿BPA浓度相关，BPA可能影响卵泡发育进而降低卵巢储备功能[4]。但安全剂量范围内的BPA对刚进入性成熟期小鼠卵巢储备功能的影响尚未见报道。本研究旨在探讨低剂量BPA亚慢性暴露是否引起雌性小鼠卵巢储备功能下降，为进一步解读BPA的卵巢毒性提供理论依据。
对象与方法
一、对象
本课题已通过武汉大学中南医院伦理委员会审批。动物实验的实施及对实验动物的应用操作已通过武汉大学A3实验室批准。动物均麻醉后取血并处死，最大程度地减少对动物的伤害。
64只5周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠，体重15～17 g，购买于武汉大学A3实验室并在此饲养应用。小鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为4组，每组16只。
二、方法
1.分组：BPA(分析纯，纯度≥97%)以玉米油为溶剂，配成5、50、500 μg/ml BPA溶液(BPA低、中、高剂量组)，仅玉米油处理作为溶剂对照组。每天上午8:00时开始小鼠称重并按10 ml/kg溶液及组别灌胃，连续处理28 d。实验动物饲养环境为昼夜12 h交替，室内温度控制在(21±2)℃，湿度控制在50%～60%，食物和水自由摄取。
2.指标观察：(1)一般体质量。每日仔细观察各组小鼠饮食、排便、活动及精神状态有无异常，每日小鼠称重并做记录，以周为单位统计体重增长的组间差异(将小鼠放入烧杯置于电子天平上称重，待天平稳定后迅速读数。若有小数位，则按照“四舍五入”原则修约)。(2)血清激素水平测定。小鼠持续BPA处理28天后，麻醉后小鼠框内静脉取血，所取血液样品于4 ℃静置3 h，低温离心机内4 ℃(3000 r/min)离心15 min，用移液枪取上清液，ELISE试剂盒(购于武汉华联科生物有限公司)检测血清AMH及E2激素水平。
3.荧光定量PCR法：检测卵巢组织中AMHmRNA的表达。卵巢组织取出后投入液氮罐中冻存，各组小鼠处理完毕后将卵巢组织取出，Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度得到可用样本。设计并合成引物，引物序列见表1。逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，在MX200096孔荧光定量PCR板中，每孔依次加入以下反应体系：cDNA 1 μl、SYBR Rremix Ex TaqTM(2X) 12.5 μl、PCR Primer(R+F) 1 μl、ROX Refence Dye 2(50X) 0.5 μl、dH2O 10 μl,总PCR体系为25 μl。按照下述条件进行扩增：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。得到各组目的基因与内参基因的Ct值，按2-△△CT法[5]计算待测目的基因表达量。
表1荧光定量PCR的引物序列
4.免疫组织化学法：检测卵巢组织AMH蛋白的表达。处死小鼠后快速获取卵巢并去除周围脂肪组织，卵巢组织经4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋，间断均匀切片，应用免疫组化试剂盒染色并镜检拍照，分别选择5个不同视野进行评分。评分标准如下。染色面积:着色细胞<5%为0分；5%～25%为1 分；25%～50%为2分；50%～75%为3分；>75%为4分。染色强度：没有着色为0分；淡黄色为1分；棕色为2分；深棕色为3分。综合得分=染色面积得分×染色强度得分。
5.统计学处理：用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计量资料以
表示，多组样本均数采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。
结 果
一、不同浓度BPA亚慢性暴露对小鼠体质量的影响
各组灌胃期间小鼠精神状态佳，饮食、排便及活动均无异常。各组小鼠体重每周体重均呈增长趋势，BPA低、高剂量组体重增长较缓慢，差异无统计学意义，见表2。
图1 不同浓度BPA亚慢性暴露对小鼠体重的影响(周)
表24组小鼠不同时间体重(g)
二、4组血清AMH、E2激素水平的影响
BPA处理组小鼠血清AMH及雌激素(E2)激素水平均低于对照组，BPA低、高剂量组下降显著，差异有统计学意义，见表3，图2。
三、4组AMH mRNA表达的影响
BPA处理组卵巢组织中AMH mRNA表达低于对照组，BPA低、高剂量组下降显著，差异有统计学意义，见表3、图3。
四、4组AMH蛋白表达的影响
BPA处理组小鼠卵巢组织中AMH蛋白表达与其mRNA表达趋势一致，AMH蛋白表达显著低于对照组，BPA低、高剂量组下降显著，差异有统计学意义，见表3、图4。AMH主要表达于卵泡腔内，极少表达于卵泡间质(图5)。
表34组AMH激素水平、雌激素、AMHmRNA及蛋白的表达
图2 4组血清激素水平比较 A.血清AMH; B.血清E2浓度。*P<0.05
图3 4组卵巢AMH mRNA表达比较*P<0.05
图4 4组AMH蛋白表达比较 与对照组比较，*P<0.05
讨 论
随着塑料制品的广泛使用，人群BPA暴露非常普遍。流行病学表明，超过90%的个体尿液中可以检测到BPA,广泛暴露于BPA对雌性生殖系统存在一定的影响[6-7]。美国环境保护署1988年首次确定50 μg/(kg·d)为人群BPA的安全参考剂量[8]，到目前依然沿用此标准。然而，安全剂量是否对所有组织器官均无毒害作用值得深思。目前文献报道，BPA在相关实验中的应用剂量相差较大，各研究阶段在种属、剂量等方面均不同，导致研究结果也存在一定的差异[9-12]。为了能够更加准确地反映BPA对雌性卵巢储备的剂量效应，选择美国环境保护署规定的安全剂量，针对性探索低剂量BPA亚慢性暴露对雌性小鼠卵巢储备功能的影响，使研究结果更有参考价值。AMH是转化生长因子B(TGF-B)超家族成员，由卵巢窦前卵泡和小窦状卵泡的颗粒细胞分泌，在卵巢颗粒细胞上表达，是卵泡生长发育的重要调节因子，其参与生理性卵泡形成过程中重要的始基卵泡募集和优势卵泡募集，目前认为卵巢颗粒细胞是人类AMH的唯一来源。AMH的浓度水平在整个月经周期中无明显变化，所以可以直接用来反映卵巢的功能状态[13]。Meczekalski等[14]研究明确指出，AMH可以作为衡量晚孕生育能力及辅助生殖妊娠结局的指标，其可以准确的评价生殖寿命。Monniaux等[15]研究证实，血清AMH激素水平可以作为评价卵巢储备功能的可靠指标，不只可应用于人群，也可以用于其他物种。
本研究选择刚刚进入性成熟期的小鼠，其卵巢处在产生雌性生殖作用的早期，结果显示，BPA可以引起卵巢储备功能下降，不仅表现在血清AMH及E2激素水平下降，基因及蛋白表达也出现明显下调，由此证实BPA对卵巢储备功能的影响存在非单调剂量效应作用，其呈现出明显的“U”型效应关系，此结果与前期对BPA生殖效应的研究保持一致[16-17]。双酚A在整个剂量范围内存在不同的作用机制，在不同剂量范围内有不同的作用机制占主导地位，在较低剂量时可能通过激素受体介导或拮抗产生特殊的生物效应，而剂量升高至一定程度时，双酚A与激素受体的作用达到饱和，与受体相关的响应逐渐被抑制，至高剂量时则表现出急性毒性机制。早在2004年，Zala等[18]已明确指出，在内分泌干扰物的毒理研究中这种非单调效应关系已成规律而非特例。基础雌激素低水平是卵巢反应性下降的预测指标，BPA能使血清雌激素水平降低，进而引起卵巢低反应。持续卵巢低反应加剧雌、孕激素水平低下，反馈性促使FSH再升高，不能刺激LH峰的出现，导致颗粒细胞萎缩、卵泡体积变小，从而阻断卵泡的发育过程。
在哺乳动物的发育过程中AMH具有性别特异性和时间依赖性，胚胎期AMH表达缺陷可导致两性畸形的发生。其在卵泡发育的启动和选择性生长中也起到重要作用，AMH在卵泡细胞中高表达，并伴随生殖细胞的消亡而表达降低，闭锁卵泡中AMH呈低表达状态，因而AMH基因低表达提示原始卵泡发育为生长卵泡的过程受到影响。BPA慢性暴露后小鼠卵巢组织AMH的表达下降，说明BPA可以加速小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡过程，促使多数卵泡发生闭锁。研究证明，BPA可影响颗粒细胞激素分泌及减数分裂过程，加速卵巢颗粒细胞的凋亡，进而引起发育卵泡的闭锁[19-20]。Durlinger等[21]研究表明，AMH缺失型小鼠比同窝出生的野生型小鼠多了近3倍的小卵泡，卵巢内的始基卵泡随着小鼠的生长而耗竭。在人卵巢组织中，出生时约有200万个卵泡，到青春期时卵泡数量约30万个左右，而在妇女生育期内可正常发育并完成排卵的卵泡只有400～500个，因此，卵巢中只有一小部分卵泡可以发育成熟并完成排卵，而大多数卵泡均退化闭锁，以致卵泡细胞缺乏再生能力，最终导致生育功能减退。BPA可能通过干预生殖细胞的减数分裂过程而加速颗粒细胞凋亡及卵泡的闭锁，使AMH呈现低表达状态。而AMH缺乏，始基卵泡也将以更快的速率被募集,导致始基卵泡池提前成熟耗竭，使生殖寿命缩短。
综上所述，亚慢性暴露于低剂量双酚A即可导致成年小鼠卵巢储备功能下降。但BPA对小窦状卵泡的数量及各级卵泡构成等影响还有待进一步研究。
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