近年来，我国雾霾污染加重。2013年1月，我国出现了持续大规模的雾霾天气，覆盖范围涉及了17个省市自治区，约占国土面积的1/4[1]。2014年2月，我国中东部发生的雾霾污染影响面积达143万平方公里，约占全部国土面积的1/7[2]。2015年全年，我国爆发了高达11次大范围、持续性雾霾污染，在某些地区PM2.5峰值浓度甚至超过1000微克/立方米[3]，极大地影响了人们的生活与健康。
目前已经有相关研究发现，孕期一定剂量的PM2.5暴露会增加出生缺陷的发生风险。Agay-Shay等[4]的队列研究结果表明，PM2.5与婴儿孤立性动脉导管未闭有关。苑晓燕[5]研究结果显示，PM2.5有体外胚胎发育毒性。但有关PM2.5发育毒性的机制研究却非常少，有效干预措施的研究更是寥寥无几。
大量研究表明，PM2.5主要毒性机制之一涉及其进入机体后对组织细胞的氧化损伤作用。PM2.5除自身带有活性氧(Reactive oxygen species，ROS)成分外[6-7]，还能刺激细胞产生大量ROS和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)物质[6]，因而可使机体内氧化损伤加重。另一方面，PM2.5暴露可引起超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性降低[8]，从而使细胞内的ROS或RNS含量增加。推测，造成母体ROS或RNS含量的增加都可能是PM2.5发育毒性的机制之一，那么安全剂量的抗氧化活性物质可能对于PM2.5的发育毒性具有一定的拮抗作用。
槲皮素是广泛存在于人类天然食物中的一类多酚类植物化学物，具有较强的自由基清除功能[9]，对超氧阴离子有直接或间接的清除作用，进而达到保护细胞免受各种不良因素的损伤，发挥其抗炎、抗纤维化、调节免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等作用[10-11]。同时，它相对安全无毒，1982年，Willhite[12]就曾报道大鼠整个孕期服用2～2000 mg/kg槲皮素对胎儿均没有明确的致畸作用，提示其用于孕期的安全性。因此，本实验拟通过体内实验评价PM2.5的胚胎发育毒性并探究槲皮素对PM2.5发育毒性的拮抗作用，同时设置抗氧化活性被广泛认可的VC对照组，以期为有效地预防和控制PM2.5对人类的发育毒性提供科学依据。
对象与方法
一、对象
1.实验材料：槲皮素(购自Sigma 公司，纯度≥95%)。
PM2.5采集和制备：采用TH-150C型号智能中流量(TSP)采样器(天虹智能仪器表厂，武汉)进行PM2.5采集，采样时间为2014年11月15日—2015年3月15日，采样地点位于北京市海淀区学院桥附近某建筑，采样高度为15 m(附近无高大建筑物阻挡)，采样流量设置为0.1 m3/min，颗粒物采集于石英滤膜上。石英滤膜在采样前和采样后分别恒温干燥24 h，称重。用灭菌手术剪将载有颗粒物的石英滤膜剪成3 cm×4 cm大小，加入超纯水，水浴超声震荡20 min，加冰保持水温在20 ℃以下，重复3次，收集洗脱液，并用6层灭菌纱布过滤。真空冷冻干燥后，用无菌PBS配制成不同浓度贮备液，-20 ℃避光保存。空白对照组的滴注液直接用干净的滤膜进行上述洗脱操作。
2.实验动物与分组：健康成年SPF级雌性ICR小鼠，体重(30±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]。动物饲养在屏障环境，温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%，昼夜照明时间为12 h:12h。动物适应性喂养1周后按体重，随机分为6组，空白对照组、PM2.5模型对照组、槲皮素低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200mg/kg)三个干预剂量组和VC干预组(100mg/kg)，每组10只。实验期间动物自由饮水和进食。槲皮素剂量的确定是参考既往中英文文献中槲皮素在孕鼠中所使用的干预剂量。
二、方法
1.实验操作：雌鼠随机分组后，每天晚上18:00将雌鼠与健康SPF级性成熟雄鼠1:1合笼，第2天早上7:00分笼并检查阴栓，见栓即认为受孕，定为孕期第0天( gestational day 0，GD 0)，所有雌鼠均受孕时停止合笼。已确定怀孕的雌鼠单笼饲养，并饲喂繁殖期饲料，每天观察孕鼠有无嗜睡、烦躁、行动不便、阴道流血等异常情况出现。孕3、6、9、12、15天称体重，并记录食物消耗量。
PM2.5染毒：各组孕鼠分别于GD3、GD6、GD9、GD12和GD15上午，在3%异氟烷短效气体麻醉下进行气管滴注，空白对照组给予1 ml/kg干净石英滤膜洗脱液滴注，其余各组按照1 ml/kg的体积滴注PM2.5溶液，染毒剂量为15 mg/kg。
灌胃：孕鼠自GD0～GD17，每日灌胃。空白对照组和PM2.5模型对照组给予0.15%羧甲基纤维素钠水溶液灌胃，3个槲皮素干预组分别给予50、100、200 mg/kg槲皮素灌胃，VC干预组给予100 mg/kg VC灌胃，槲皮素和VC均以0.15%羧甲基纤维素钠作为分散系。
孕18天处死所有孕鼠。
2.母鼠血清抗氧化指标检测：孕18天用摘眼球取血法收集孕鼠血液，静置30 min后离心分离血清，进行抗氧化指标检测。抗氧化指标包括过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)，所用试剂盒均由碧云天公司生产，货号分别为S0051和S0053，所有操作均按照试剂盒说明书进行。
3.胚胎毒性和骨骼发育检测：收集血样后，颈椎脱臼法处死孕鼠，迅速完整分离子宫后称量子宫连胎重。称重后迅速剖开子宫，记录活胎数、死胎数、吸收胎数，称量活胎及其胎盘重量并测量胎鼠身长和尾长，每窝取半数活胎放入Bouin's液固定，以备进行内脏畸形检查，另外半数放入95%乙醇中固定，以备进行骨骼畸形检查。
4.统计学处理：数据均采用SPSS 20.0软件进行分析。其中，胚胎毒性部分和肋骨畸形的数据用χ2检验，枕骨骨化情况的数据采用非参数检验进行分析，其他数据则采用单因素方差分析( one-way ANOVA)，方差齐时利用LSD法进行两两比较，方差不齐时采用Tamhane’s T2法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、母鼠血清抗氧化指标
PM2.5模型对照组母鼠血清中的CAT活力显著低于空白对照组，VC干预组和三个槲皮素干预组较PM2.5模型对照组有所改善，其中槲皮素低和中剂量组的CAT活力与PM2.5模型对照组相比，差异均有统计学意义；组间血清中GSH含量比较，差异无统计学意义；见表1。
表1槲皮素对孕期PM2.5染毒母鼠血清中抗氧化指标的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.05；与PM2.5模型对照组比较，#P<0.05
二、胚胎毒性
孕期PM2.5染毒对胚胎的发育和存活影响不大，未呈现明显的胚胎毒性。各组的活胎数量、吸收胎数量和死胎数量比较，差异无统计学意义，见表2。与其他组相比，VC干预组的胚胎毒性最大。
三、胎鼠情况
PM2.5模型对照组的平均胎鼠体重显著低于空白对照组，VC干预组和三个槲皮素干预组较PM2.5模型对照组平均胎鼠体重有所增加，槲皮素中剂量组与PM2.5模型对照组的平均胎鼠体重比较，差异均有统计学意义；PM2.5模型对照组的胎鼠身长显著低于空白对照组差异有统计学意义；其余各组与PM2.5模型对照组相比，均有不同程度的改善，其中槲皮素中剂量组与PM2.5模型对照组比较，差异有统计学意义；组间胎盘重、胎鼠身长比较，差异无统计学意义；见表3。
表2槲皮素对孕期PM2.5染毒母鼠胚胎毒性的影响
表3槲皮素对PM2.5染毒孕鼠的胎鼠体重、胎盘重、胎鼠身长、胎鼠尾长的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.05；与PM2.5模型对照组比较，#P<0.05
四、胎鼠外观、内脏和骨骼发育情况
各组活胎胎鼠外观检查和内脏检查均未发现明显畸形。骨骼观察结果发现，与空白对照组相比，PM2.5模型对照组胎鼠14肋骨畸形和枕骨骨化不全的发生率明显增加，差异有统计学意义；与模型对照组相比，槲皮素三个干预组的14肋骨畸形情况得到改善，槲皮素三个干预组的枕骨骨化情况也均有明显的改善，差异有统计学意义；此外，通过比较发现，VC干预在一定程度上增加了PM2.5所致后代骨骼畸形的发生；见表4。
表4槲皮素对胎鼠骨骼发育的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.05；与PM2.5模型对照组比较，#P<0.05；两两比较时经Bonferroni校正(α调整=0.05/15=0.0033)
讨 论
研究表明，大气中可吸入颗粒物会对胎儿的宫内发育造成一定影响。van den Hooven等[13]对荷兰7 772名母婴队列研究发现，妊娠后3个月暴露于PM10和NO2可减少胎儿头围。施淼等[14]对畸形胎儿的病例对照研究发现，妊娠1～3个月PM10暴露浓度越高，胎儿血管畸形的危险性越高。相对于PM10，PM2.5由于其比表面积大，易携带大量有毒有害物质经呼吸道进入人体肺部深处及血液循环，被认为对人体产生的危害更大[15-16]。
本研究结果发现，孕期以15 mg/kg PM2.5染毒可产生一定的胚胎发育毒性，表现为胎鼠体重下降和胎鼠身长缩短。三个槲皮素干预组的胎鼠体重和胎鼠身长均较模型对照组有不同程度的增加，提示孕期膳食中补充槲皮素可以在一定程度上改善胚胎的生长发育，但这一效应在本研究剂量下并没有呈现剂量-效应关系，而是中剂量组的改善效果整体最好，低和高剂量组均稍差，提示槲皮素在改善胚胎发育状况存在一个最佳剂量范围。此外，PM2.5染毒可导致14肋骨畸形的发生率增加和枕骨骨化不全程度加重。槲皮素干预后，14肋骨畸形的发生率下降和枕骨骨化不全程度得到改善，且与PM2.5模型对照组相比，三个槲皮素干预组的枕骨骨化不全程度的改善。而各组间活胎率、死胎率和吸收胎率差异无统计学意义，且活胎率均较高，这可能提示在本研究的剂量范围内，虽然PM2.5会影响胚胎的生长发育以及具有一定的发育毒性，但由于机体具有胎盘屏障等保护机制，并不会造成较多死胎、吸收胎的严重后果。
ROS在PM2.5毒性过程中可能发挥重要的作用，而机体为避免受到内源性或外源性ROS的损伤，在进化过程中形成了一整套代谢的抗氧化系统，主要由酶和抗氧化剂组成，如CAT、SOD、GSH等。本实验通过对孕鼠血清中抗氧化指标的分析发现，孕期PM2.5染毒可以使母鼠血液中的过氧化氢酶(CAT)活力显著下降，而一定剂量的槲皮素干预，逆转了母鼠机体的氧化应激水平，与之相应仔鼠的发育毒性也在一定程度上得到了抑制，这一结果提示PM2.5致发育毒性的机制之一可能是其引发的氧化损伤。但另一方面，本研究中只有槲皮素低剂量组和中剂量组的CAT活力显著提高，而高剂量槲皮素干预组的抗氧化效果反而不及中低剂量组，说明槲皮素的抗氧化作用在生物体内发挥时具有适宜的剂量范围，剂量过高时反而可能加重氧化损伤。这一点之前已有相关报道，如刘爽等[17]的研究发现乙醇染毒肝细胞用100 μmol及以上的槲皮素干预时，CAT的水平与乙醇模型组反而无差异，而在低于该剂量时抗氧化效果明显。姚芳芳等[18]的动物实验结果表明，当槲皮素干预剂量达到40 mg/kg和50 mg/kg时，血清SOD活性下降、MDA含量上升。
VC是公认的氧自由基清除剂，本研究选择它作为阳性对照组。结果发现VC组的母鼠血清中抗氧化指标较PM2.5模型对照组有所改善，说明VC的抗氧化作用得以实现，但是拮抗PM2.5发育毒性的效果却不佳，甚至在一定程度上加重了PM2.5的发育毒性。分析其原因可能是PM2.5诱导发育毒性的机制众多，氧化损伤只是其中之一。100 mg/kg VC虽然在一定程度上拮抗了部分氧化损伤作用，但尚不足抵消其他原因导致的发育毒性，甚至由于PM2.5比表面积较大，表面携带的成分非常复杂[19]，包含很多无机组分和有机组份，VC本身作为一种还原性较强的化学物质，不排除其与PM2.5上的某些特殊成分发生反应，增强该成分的发育毒性甚至生成具有发育毒性物质的可能，而这些物质作用的结果不足以被VC抗氧化的保护作用抵消，整体结果表现为发育毒性不减反增的情况，但具体机制还需要待进一步探讨。
综上，本实验结果提示，一定剂量的槲皮素可以拮抗PM2.5的发育毒性，但存在适宜的剂量范围，并非剂量越高拮抗效果越好。在槲皮素拮抗PM2.5发育毒性的机制中，抗氧化可能发挥了一定作用，但具体作用机制尚需进一步的研究。
参考文献
1 《2013年空气污染(雾霾)健康影响监测工作方案》解读.
2 王庚辰,王普才.中国PM_(2.5)污染现状及其对人体健康的危害.科技导报,2014,32:72-78.
3 2015年中国气候统计公报.
4 Agay-Shay K.Air pollution and congenital heart defects.Environ Res,2013,124:28-34.
5 苑晓燕,李利忠,卢春凤,等.PM2.5对大鼠体外全胚胎发育的影响.北京环境诱变剂学会第十二届学术交流大会论文集,2012.
6 Valavanidis A,Vlachogianni T,Fiotakis K,et al.Pulmonary oxidative stress inflammation and cancer:respirable particulate matter,fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms.Int J Environ Public Health,2013,10:3886-3907．
7 Longhin E,Holme JA,Gutzkow KB,et al.Cell cycle alterations induced by urban PM2.5 in bronchial epithelial cells:characterization of the process and possible mechanisms involved.Particle and Fibre Toxicol,2013,10 :63．
8 Li YJ,ShimizuT,HirataY,et al.EM703 inhibit NF-κB activation induced by oxidative stress from diesel exhaust particle in human bronchial epithelial cells:importance in IL-8 transcription.Pulm Pharmacol Ther,2013,26:318-24.
9 Li Y,DengY,Tang Y,et a1.Quercetin protects rat hepato—cytes from oxidative damage induced by ethanol and iron by maintaining intercellular liable iron pool.Human and Experimental Toxicology,2014,33:534-541.
10 卢春风,陈廷玉,王淑秋,等.槲皮素抑制离体大鼠肝星状细胞增殖.中国病理生理志,2005 2l:1154-1166.
11 Yoon JS,Lee HJ,Chae MK,et al.Cigarette smoke extract-induced adipogenesis in Graves’ orbital fibroblasts is inhibited by quercetin via reduction in oxidative stress.Journal of Endocrinology,2013,216:145-156.
12 Willhite CC.Teratogenic potential of quercetin in the rat.Food-Chem Toxicol,1982,20:75-79.
13 Van den Hooven EH,Pierik FH,de Kluizenaar Y,et al.Air pollution exposure during pregnancy,ultrasound measures of fetal growth,and adverse birth outcomes:a prospective cohort study.Environ Health Perspect,2012,120:150-156.
14 施淼,刘超斌,陈晓秋,等.大气可吸入颗粒物暴露致胎儿畸形的病例对照研究.中华围产医学杂志,2013,16:200-205.
15 郭新彪,魏红英.大气PM_(2.5)对健康影响的研究进展.科学通报,2013,58:1171-1177.
16 Zhuang X,Wang Y ,He H ,et al.Haze insights and mitigation in China:an overview.J Environ Sci(China),2014,26:2-12.
17 刘爽,姚平,李珂,等.槲皮素对大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤的防护作用.营养学报,2007,29:288-291.
18 姚芳芳,张锐,傅瑞娟,等.槲皮素对高尿酸血症大鼠肾损伤的防治作用.卫生研究,2011,40:175-177.
19 方冬青,魏永杰,黄伟,等.北京市2014年10月重霾污染特征及有机碳来源解析.环境科学研究,2016,29:12-19.