不孕症已成为影响人类发展与健康的一个全球性医学和社会学问题。不孕症患者不仅承受着身体痛苦，且多数伴有明显的抑郁焦虑等心理压力[1]，严重影响患者的生活质量。Meta分析发现我国总合并不孕率为5.7%，新婚人群1年和2年合并不孕率分别为12.5%和6.6%[2]。不孕症病因复杂，盆腔感染[3]、精神压力大[4]、多次人工流产术[5]、粉尘接触等不良环境因素[6-7]均是不孕症的危险因素。
叶酸缺乏和叶酸利用不足被认为与不孕的发生有关。作为叶酸代谢的关键酶，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydro folate reductase,MTHFR)基因多态性与男性不育、复发性(习惯性)自然流产的发生有关[8-10]。本课题组前期研究发现，编码儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O- methyltr1ansferase,COMT)的COMT基因可能单独或与MTHFR基因联合作用参与叶酸代谢过程[11]。此外，COMT由于参与雌激素的合成和代谢过程，在多囊卵巢综合征、卵巢早衰、子宫内膜异位症等导致不孕症的常见疾病中被广泛关注。COMT基因突变可引起酶的活性改变，引起DNA氧化损伤，引起卵泡发育迟缓导致不排卵或者卵巢早衰[12]。关于MTHFR和COMT血浆蛋白表达产物是否与不孕有关，目前尚未见报道。本研究将对以上关系进行探索，对进一步阐明我国不孕症的发病机制和确定筛选高危人群或易感个体的分子标志物具有理论意义，从而为实施目标明确的个体预防、制定基于人群的预防干预措施提供理论依据。
对象与方法
1.对象：课题组于2009年11月—2012年7月在山西省两县(寿阳县和昔阳县)利用婚前保健项目募集研究对象，建立婚检妇女队列。新婚夫妇在领取结婚证前均先进行免费的婚前医学检查。项目县同时建立了孕产期保健系统，新婚妇女怀孕后，均需要到其所在地的县妇幼保健院建册登记，该系统可随时记录新婚妇女的怀孕结局。随访追踪妇女新婚1年后的怀孕结局，确诊不孕妇女后，采用1:1匹配病例-对照研究。病例为婚检时未怀孕、1年内有怀孕计划，婚后未避孕、有正常性生活、同居1年内未怀孕者，排除男性不育因素且未接受过治疗；经腹腔镜手术检查排除输卵管、子宫等内生殖器官的先天性病变、阻塞和生殖器结核等，排除经二级以上医院诊断的多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等临床疾病患者。对照组为同期募集的年龄和居住地相近、婚后未避孕、有正常性生活、同居1年内怀孕的妇女。本研究获北京大学生物医学伦理委员会审批，研究对象进行问卷调查和采集血标本前，征得本人同意并在知情同意书上签字。
2.调查内容：设计调查表，收集研究对象人口学特征(如年龄、受教育程度、职业等)、既往生育史和患病史、叶酸增补情况、生活环境暴露(如农药、有机溶剂、重金属等)、生活方式(如吸烟、饮酒、饮茶)和营养状况等信息。调查由经过培训的调查员完成。对调查表的流行病学资料采用双重录入和逻辑核查对数据录入进行质量控制。
3.不孕夫妇的临床检查：不孕夫妇的临床检查由当地妇幼保健院妇科和男科医生负责。女性检查包括问诊、体检、血生化检查、阴道B超、输卵管通液等。男性检查包括问诊、体检、血生化检查、精液常规检查等。精液分析用于排除男性不育原因。
4.生物样本的采集和检测：符合条件的婚检妇女募集时采集外周肘静脉血6 ml。采用微生物法检测血液叶酸浓度，酶联免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)检测COMT和MTHFR血浆蛋白表达水平，酶联免疫吸附试验试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司)，实验步骤严格按照说明书执行，加入终止液后在450 nm处测吸光度值，根据标准曲线测算标本内目标蛋白含量。
5.统计学处理：所有数据用SPSS Statistics 19.0软件包进行处理。计量资料以
表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.研究对象的一般特征：队列共募集了2 035名参加婚检并计划在未来12个月内生育的妇女，并随访了妊娠结局信息。随机抽取20例不孕妇女为不孕组，20例怀孕妇女为对照组。
40例研究对象平均年龄(25.9±3.0)岁，平均体重指数(24.9±4.7)kg/m2。受教育程度以初中为主，从事职业以农业为主；两组年龄、居住地、受教育程度比较，差异无统计学意义；体重指数、职业比较，差异有统计学意义，见表1。两组均未患乙型肝炎、甲亢、贫血、糖尿病、高血压、癫痫等慢性病。不孕组服用叶酸比例为5.3%，日常接触汽油等有机溶剂的比例、居住地2公里内有其他矿的比例、家里养猫/狗的比例、做饭使用烟煤的比例均高于对照组，但差异无统计学意义。
2.两组血液叶酸水平比较：不孕组叶酸水平略高于对照组，但差异无统计学意义，见表2。
3.两组MTHFR、COMT血浆表达蛋白水平比较：不孕组MTHFR、COMT血浆蛋白表达水平均略高于对照组，但差异无统计学意义，见表2。
表1两组一般特征比较
注：两组比较，*P<0.05
表2两组叶酸、COMT、MTFHR血浆蛋白水平比较
讨论
不孕症病因复杂，叶酸缺乏或利用不足均增加不孕发生风险，且逐渐受到重视。叶酸参与体内一碳单位转运，为合成DNA、RNA所必需，是胚胎发育过程中不可缺少的微量营养素。叶酸是人体自身无法合成，需要通过外源性食物摄取的B族水溶性维生素。
叶酸进入体内的代谢和利用受到叶酸代谢相关基因调控的影响。备受关注的是MTHFR，其677CT和1793GA基因型在女性对照组远远高于原因不明性不孕组[10]，MTHFR与其他基因交互作用增加子宫内膜异位症相关的不孕发生风险[11]；也有研究指出，MTHFR677C>T变异引起的酶的活性改变并不影响IVF的种植率[12]。也有研究并未发现MTHFR基因多态性(677C>T和1298A>C)与不孕发生风险有关[13]。本课题组前期研究发现，COMT基因可能单独或与MTHFR基因联合作用参与叶酸代谢过程，导致体内同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平升高，产生神经管缺陷等不良结局[11]。COMT基因突变导致酶的活性降低，通过增加组织中雌激素和儿茶酚含量，引起DNA氧化损伤，从而增加激素依赖性的疾病发生风险[13]。研究者发现，多囊卵巢综合症中，由于COMT过表达，卵巢颗粒细胞中由羟雌二醇(2-hydroxyestradiol,2-HE)甲基化生成的甲氧雌二醇(2-Methoxyestradiol,2-ME)增加，类固醇生成障碍，卵泡发育迟缓，导致不排卵[14]。巴西研究者最近研究发现，在卵巢早衰细胞中，则表现出相反的趋势，COMT rs4680等位基因A的频率基因突变可增加与卵巢早衰的发生，卵巢早衰患者等位基因A的频率高于对照组；卵巢早衰患者COMT活性降低，2-ME生成减少，促进卵泡衰竭，最终导致卵泡发育迟缓[15]。最近的一项Meta分析发现，COMT158G/A多态性位点显著增加子宫内膜异位症和子宫腺肌症的发生风险，特别是在亚裔人群中[16]。但是也有研究得出不一致的结论，例如美国研究者发现COMT基因多态性不是多囊卵巢综合症的危险因素[17]，巴西研究者并未发现COMT rs4680(val/met)突变与子宫内膜异位症合并不孕有关[18]。
关于COMT的蛋白表达，研究不多。例如研究者通过Western-blot方法检测重度子痫前期产妇胎盘组织COMT蛋白表达量明显低于正常产妇，推测胎盘组织中的COMT参与重度子痫前期的发病[19]；也有研究通过采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测妊娠妇女胎盘组织COMT mRNA的水平，发现子痫前期组胎盘组织COMT mRNA水平明显低于对照组[20]，但是具体机制有待进一步研究。对结直肠癌的研究发现，结直肠癌组可溶性COMT(S-COMT)蛋白的表达水平显著高于正常结直肠黏膜，可能与COMT高表达导致癌组织中雌激素分解代谢增加有关[21]。COMT和MTHFR在不孕症中的表达尚无报道。本研究发现，COMT和MTHFR在不孕组略高于对照组，可能与激素水平改变有关。由于样本量所限，本研究未进一步对不孕类型区分。
不孕症的发生是基因、环境及基因—环境共同作用的结果。本研究通过小样本量的研究初步探究了叶酸代谢通路上关键酶的表达水平与不孕症的关系，血液中与叶酸代谢相关的蛋白表达水平是否有所改变是本研究的重要关注点。本研究初步揭示了不孕组COMT、MTHFR血浆蛋白均略高于对照组，血液中与叶酸代谢相关的蛋白表达水平与不孕症的关系，有待今后大样本量的研究去验证。
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