宫颈癌是一种发生率较高的妇科恶性肿瘤疾病，其发生、发展与癌基因激活、抑癌基因失活之间存在密切的相关性关系[1]。Survivin是目前已知生理功能最为强大的凋亡抑制因子，可有效抑制Caspase-3、Caspase-7的活性功能，最终抑制细胞凋亡现象[2]。野生型p53基因在细胞凋亡、细胞分化、血管组织形成和DNA生理代谢等多个过程中均发挥着重要的作用，但其出现异常突变可使得正常生理功能丧失，具有癌基因的生理学活性作用，最终促进肿瘤疾病的发生、发展[3,4]。目前关于Survivin、p53与宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的临床研究相对较少，因此本研究拟观察两者的表达情况，并判断其是否可作为早期诊断宫颈癌前病变的生物标志，进而评估疾病预后情况。
对象与方法
1.对象：2013年5月—2015年12月本院收治女性宫颈疾病患者195例，其中慢性宫颈炎40例，宫颈上皮内瘤变83例(CINⅠ期26例，CINⅡ期27例，CINⅢ期30例)，宫颈癌72例，均经病理组织检查均已确诊。本研究方案已通过院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。
2.实验仪器及试剂：兔抗人多克隆Survivin及抗体(工作液浓度1:100)、鼠抗人单克隆p53抗体(工作液浓度1:200)购自美国Santa Cruz公司；Elivision免疫组化试剂盒购自北京金桥生物技术有限公司，羊抗兔、羊抗鼠二抗及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。
3.实验方法：采用免疫组织化学(Elivision二步法)法检测Survivin、p53在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达情况。采用10%甲醛溶液固定处理所有组织标本，石蜡包埋后连续切片，切片厚度为5 μm，梯度乙醇溶液水化处理，随后高温高压环境下修复作用3 min，采用3%双氧水溶液孵育作用10 min，PBS缓冲液洗涤组织切片3次，加入适量Survivin或p53一抗，室温环境条件下孵育作用2 h，随后加入适量二抗工作液，室温环境条件下孵育作用1 h，PBS缓冲液洗涤组织切片3次，DAB显色剂显色处理，最后使用苏木精溶液复染，封片后镜下观察，整个实验步骤严格遵守说明书进行操作。
4.染色结果判断方法：普通显微镜下观察组织切片的显色反应，Survivin阳性表现为细胞浆中出现淡黄色或棕黄色颗粒，p53阳性表现为细胞核中出现浅黄色或棕黄褐色颗粒，高倍镜下随机选择5个视野，根据阳性细胞数占整个细胞的百分比予以记分。0分：阳性细胞数百分比<5%；1分：5%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：阳性细胞数百分比>75%。根据着色强度予以记分，1分：淡黄色，2分：黄色，3分：棕黄色。两者得分乘积即为阳性表达强度：0分：(-)，1～4分：(+)，5～8分：(++)，9～12分：(+++)。
5.统计学处理：均采用SPSS 17.0软件进行数据分析，率比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，采用Spearman法分析两者之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.Survivin在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达：Survivin在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期和宫颈癌组织中的阳性表达率分别为7.5%，30.8%，44.4%，60.0%，77.8%，呈依次升高趋势，差异有统计学意义，见表1及图1。
图1 Survivin在不同宫颈病变的表达 A.宫颈癌组织；B.宫颈上皮内瘤变；C.慢性宫颈炎
2.p53在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达：p53在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期和宫颈癌组织中的阳性表达率分别为5.0%，23.1%，37.0%，53.3%，72.2%，呈依次升高趋势，差异有统计学意义，见表2及图2。
图2 p53在不同宫颈病变的表达 A.宫颈癌组织；B.宫颈上皮内瘤变；C.慢性宫颈炎
3.Survivin、p53与宫颈癌的临床病理关系：宫颈癌Survivin表达阳性率在FIGO分期、间质浸润深度、淋巴结是否转移方面与差异；宫颈癌p53表达阳性率则在淋巴结是否转移、组织学类型及分级方面有差；宫颈癌鳞癌与腺癌Survivin表达阳性率差异无统计学意义，宫颈癌鳞癌与腺癌p53表达阳性率差异有统计学意义，见表3。
表1 Survivin在3种组织中的表达[例(%)]
注：与慢性宫颈炎比较，*P<0.05；与CINⅠ期比较，#P<0.05；与CINⅡ期比较，▲P<0.05；与CINⅢ期比较，○P<0.05
表2 p53在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达
注：与慢性宫颈炎比较，*P<0.05；与CINⅠ期比较，#P<0.05；与CINⅡ期比较，▲P<0.05；与CINⅢ期比较，○P<0.05
表3 Survivin、p53与宫颈癌的临床病理关系[例(%)]
注：与鳞癌、Ⅰ期、≤浅肌层、无淋巴结转移比较，*P<0.05；与Ⅱ期比较，#P<0.05
讨论
Survivin在调节和控制细胞周期、抑制细胞凋亡现象等方面起到相当重要的作用，可直接阻断Caspase-3、Caspase-7的生物学效应作用，同时还可有效抑制多聚ADP核糖聚合酶的生物学活性功能，进而抑制细胞出现凋亡，最终导致细胞发生异常增殖和恶性转化，与多数肿瘤疾病的产生和预后有着密切的相关性[5]。细胞研究结果显示[6]，Survivin表达水平过高可使得cyclin D1、C-myc表达水平显著性增高，进而导致细胞异常增殖和恶性转化。本研究发现宫颈癌组织中Survivin阳性表达率(80.6%)明显高于慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变组织，此结果提示Survivin在宫颈癌组织中的基因表达明显上调，使得细胞生长出现异常紊乱，有利于肿瘤细胞增殖和侵袭周围正常组织，因此，可知Survivin可作为早期诊断宫颈癌的实验室标志物[7]。此外本研究还发现，Survivin阳性表达率在FIGO分期、间质浸润
深度、淋巴结是否转移方面有差异，提示Survivin表达水平越高，则临床分期及病灶浸润深度越严重，更易侵袭周围正常组织并发生远处转移，导致术后生存期明显缩短，即Survivin表达水平过高预示宫颈癌患者预后情况较差。
p53与细胞周期蛋白(cyclins)相互结合可形成特异性的复合体，进而有效抑制依赖cyclins的相关激酶的生物学活性功能，导致细胞在G1期出现停滞或诱导细胞程序性死亡，最终清除可能发生癌变的异常细胞[8-9]。当p53基因出现异常突变时，可使得稳定蛋白质难以抑制细胞异常增殖过程，从而促进细胞呈恶性转化，使得p53基因由抑癌基因转为原癌基因[10]。但目前p53在宫颈癌患者预后情况方面的预测价值尚缺少相关报道，本研究发现，宫颈癌组织p53阳性表达率明显高于其他组织，提示p53基因突变与宫颈癌疾病的发生、发展有密切的相关性。此外研究还发现，宫颈癌p53表达阳性率在淋巴结是否转移、组织学类型及分级方面有差异，提示p53表达与宫颈癌的组织学类型、分级有一定相关性，且在淋巴结是否转移及病情预后方面具有一定预测价值。
综上所述，Survivin、p53与宫颈癌疾病的发生、发展有密切关系，尤其与淋巴结转移的关系更为密切，此外前者还与临床分期和病灶侵袭周围正常组织有关，后者则与肿瘤恶性程度有关，均可作为检测宫颈癌前病变的生物标志，并用于判断宫颈癌患者的预后情况。
(图1、图2见封底)
参考文献
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