胚胎着床受诸多因素的精细调控，成功的胚胎植入必须有同步发育的正常胚胎、容受性的子宫内膜以及胚胎-母体之间不断进行相互对话来实现。有研究认为胚胎移植反复着床失败(repeated implantation failure ，RIF)的主要原因是子宫内膜容受性不良[1]。如何改善子宫内膜的容受性、增加母-胎之间的相互交流，以提高胚胎种植成功率是生殖医学研究的热点与难点问题。胚胎在移植入宫腔后呈游走状态，大约30%的患者在移植后出现子宫收缩活动增加[2]。在胚胎移植前使用缩宫素受体拮抗剂阿托西班则可有效减少子宫内膜蠕动，抑制子宫收缩，明显提高RIF患者的临床妊娠率和胚胎着床率[3]。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是种植前胚胎所分泌的早期信号分子,它启动和控制胎盘绒毛膜细胞的侵袭及种植，在胚胎着床及妊娠的维持中发挥重要作用。在胚胎移植前宫腔灌注hCG可明显改善卵细胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection ，ICSI)患者的临床妊娠结局[4]。能否在增加宫腔内着床相关因子浓度的同时有效抑制子宫收缩，进一步提高RIF患者的妊娠率？本研究基于此，纳入反复着床失败后再次行冻融胚胎复苏囊胚移植的患者，移植前半小时静脉推注缩宫素受体拮抗剂阿托西班，并于移植前7 min行宫腔内灌注rhCG，观察其对临床结局的影响。
资料与方法
1.研究对象：选取2014年6月—2016年6月因女方输卵管因素或男方因素在本院生殖医学中心行体外受精/卵细胞浆内单精子显微注射技术(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI)治疗反复移植失败，再次行冻融胚胎囊胚培养或冻融囊胚移植的病例，纳入标准为(1)女性年龄≤40岁；(2)至少3次胚胎移植(ET)失败史(包括新鲜周期及冷冻周期)；(3)或既往移植胚胎数>10枚仍未获得临床妊娠，且所移植胚胎中至少含有1枚优质胚胎；(4)无移植困难。排除宫腔病变及严重子宫畸形，无子宫肌瘤及子宫内膜异位症，无输卵管积水，术前宫腔镜检查无异常，双方无染色体异常。根据是否使用阿托西班和rhCG分为三组，A组共155例，于移植前半小时静脉推注阿托西班(醋酸阿托西班注射液,6.75 mg/0.9 ml，瑞士辉凌制药)预处理；B组共32例，于移植前半小时静脉推注0.9 ml阿托西班，并于移植前7 min用移植管向宫腔内注射500 U用胚胎培养液稀释至40 μl的rhCG(艾泽，250 μg/0.5 ml，默克雪兰诺有限公司)；C组为对照组，共182例，未使用rhCG及阿托西班。
2.胚胎及囊胚的冷冻、复苏：胚胎采用玻璃化法冷冻保存，解冻后有2个以上的III级以下胚胎且经患者知情同意后行囊胚培养，如D5无囊胚形成继续培养至D6。第5/6天( D5/D6) 分别观察囊胚形成情况及形态，囊胚评分采用Gardner评分系统[5]，选择囊胚在4期以上，内细胞团评分在B级以上，滋养外胚层评分在C及以上的囊胚进行新鲜囊胚移植。囊胚的解冻为移植前两小时进行，移植前对移植的囊胚行激光打孔辅助孵出，根据胚胎复苏及移植方案分为移植鲜囊胚和移植冻融囊胚两种。
3.子宫内膜准备：子宫内膜的准备方案分为自然周期、促排卵周期、激素替代周期。自然周期/促排卵周期根据阴道超声监测，以排卵日为D0、D3为卵裂期胚胎解冻日，D5为囊胚解冻移植日；激素替代周期以注射黄体酮日为 D0、D3为卵裂期胚胎解冻日，D5为囊胚解冻移植日。
4.移植后黄体支持：三组患者移植后均给予黄体支持治疗,肌肉注射黄体酮60 mg/d,并口服地屈孕酮片10 mg,每日2次。
5.妊娠结局评价：囊胚移植后D14进行血清β-hCG检测，若β-hCG>5 U/L，则定义为生化妊娠，D28天B超检查见孕囊者则定义为临床妊娠。
6.统计学处理：采用SPSS 18.0统计学软件处理数据，计量资料用
表示，均数比较采用t检验，计数资料以率(%)表示,组间比较用χ2检验或者Fisher确切概率法检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.一般资料分析：各组患者在不孕年龄、不孕年限、不孕因素等方面差异均无统计学意义，三组间子宫内膜准备方案、囊胚移植方案、平均移植囊胚数及子宫内膜厚度差异均无统计学意义。见表1。
表1各组间临床资料分析
2.各组间临床结局分析:RIF患者行TET移植前半小时静脉注射小剂量缩宫素受体拮抗剂阿托西班后，无论是否联合应用宫腔灌注rhCG，A组和B组的临床妊娠率和胚胎着床率均显著高于对照组C组，差异均有统计学意义；A组的临床妊娠率和胚胎着床率亦稍高于B组，但差异无统计学意义；A组自然流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率均稍高于B组和C组，但三组间差异无统计学意义。见表2。
表2各组间临床结局分析[例(%)]
注：与C组比较，*P<0.05
讨论
目前多数学者主张将反复着床失败(RIF)定义为移植≥3次优质胚胎或多次移植胚胎数量累计≥10枚均未能获得临床妊娠[6]。RIF发生的具体原因尚不完全清楚，可能是多种因素造成,包括子宫畸形、血栓前状态、免疫因素、夫妻双方染色体因素、胚胎因素等多种因素。胚胎质量及子宫内膜容受性是决定体外受精-胚胎移植(IVF-ET)是否成功两个最基本的因素，当移植优质胚胎反复着床失败，排除患者全身系统性疾病及子宫器质性病变后，要考虑子宫内膜的容受性。Pierzynski等[7]研究发现RIF患者子宫收缩较正常生育期的女性明显增加，超声声像图显示内膜蠕动频率增加，致使胚胎不易着床，或使胚胎不能在宫腔内着床导致异位妊娠，甚至使着床后的胚胎在发育阶段流产。RIF患者在反复移植优质胚胎失败后，精神紧张、压力增大等负面影响也可能导致子宫收缩活动增加，从而导致着床失败和不良IVF结局。在促排卵周期中血清雌二醇水平升高使子宫肌层缩宫素受体基因的表达增加，从而增加了非妊娠子宫对缩宫素的反应性，过度的宫缩降低了胚胎着床率和临床妊娠率[8]。
另外，胚胎移植时移植管进入宫腔的持续时间越长，或移植管碰触宫壁均可增加宫缩，降低胚胎着床[7]。在本研究中，纳入研究的患者内膜厚度>7 mm，同时排除了子宫内膜息肉、子宫畸形及宫腔粘连等可能影响着床的病例，并且研究组与对照组间移植优质胚胎的个数无明显差异，夫妻双方均无染色体异常，排除了因胚胎本身质量差异对妊娠结局的影响，并排除移植困难者，目的是确保同一性，减少人为因素造成的影响。本文结果发现，未使用缩宫素受体拮抗剂，RIF患者囊胚移植的临床妊娠率只有41.2%，胚胎着床率只有32.1%，而移植前使用缩宫素受体拮抗剂预处理后，患者的临床妊娠率及胚胎着床率均明显提高，提示移植前使用缩宫素受体拮抗剂能有效减少宫缩，帮助胚胎着床。
阿托西班是缩宫素受体拮抗剂,通过与缩宫素竞争位于子宫肌细胞膜、蜕膜、胎膜上的缩宫素受体,抑制细胞内质网Ca2+的释放,阻断Ca2+内流，同时,抑制缩宫素诱导的前列腺素F2a(PGF2a)的产生,从而在受体水平抑制缩宫素对子宫的收缩作用,在早产的保胎治疗中有良好的效果。而且阿托西班对人精子活力或兔胚胎发育无任何毒性，对人胚胎未发现有致畸作用，是一种安全有效的保胎药物[9]。2007年Pierzynski等[7]首次将阿托西班应用于RIF患者获得妊娠并分娩健康胎儿。阿托西班可能通过减少子宫内膜蠕动及子宫收缩,增加子宫内膜血流,改善内膜容受性，提高RIF患者再次IVF及冻融周期的临床妊娠结局[10-11]。本研究选择RIF患者再次行TET治疗移植囊胚的病例，移植前半小时使用小剂量阿托西班6.75 mg预处理，结果显示观察组的着床率及妊娠率均显著高于对照组，而宫外孕率和流产率并没有增加，进一步证实阿托西班可以改善子宫内膜容受性，提高RIF患者的临床结局。
研究发现，当精、卵结合形成受精卵后，尚处在输卵管中的胚胎就不断释放信号与子宫内膜间相互交流，发育中的胚胎通过分泌IL-1、LIF、hCG等多种信号分子促使母体子宫内膜发生适应性的变化，以利于胚胎的粘附与着床[12]，这些细胞因子在母-胎对话及胚胎着床中起着极其重要的作用[13]。而hCG作为着床前胚胎分泌的一种主要分泌蛋白，当注射到宫腔内直接作用于子宫内膜后，能迅速刺激子宫内膜分泌与着床密切相关的细胞因子如LIF、VEGF、MMP-9等，在胚胎着床及妊娠的维持中发挥重要作用[14]。目前hCG试剂有尿源性hCG粉末和重组人hCG注射液，前者价格低廉但药物纯度低于基因重组的注射液制剂。Rosen等[15]的研究认为,未提纯的hCG对小鼠胚胎具有毒性作用,而宫腔注射高纯度的hCG可以提高种植率。Santibanez等[16]在胚胎移植前宫腔灌注500 U的重组人hCG明显提高了IVF周期的临床妊娠率，并没有观察到副作用。国内学者[17]将宫腔灌注重组人hCG应用在RIF患者冻融胚胎移植前，也获得了良好的妊娠结局。本研究将宫腔灌注rhCG和静脉注射阿托西班联合应用于RIF患者再次行冻融胚胎囊胚移植前。观察发现，两者联合应用后，患者的临床妊娠率达到62.5%，胚胎着床率达到46.7%，均显著高于未处理者；虽然临床妊娠率和着床率稍低与单独应用阿托西班组，但差异并无统计学意义，而且联合应用后流产率和多胎率均较低，尚无异位妊娠发生。但因联合应用组患者病例数较少，宫腔灌注rhCG联合静脉注射阿托西班是否优于单独静脉注射阿托西班预处理，还需更大样本量的试验来进一步验证。
总之，阿托西班作为安全有效的宫缩抑制剂，有利于减少宫缩及子宫内膜蠕动，改善子宫内膜容受性，提高RIF患者的临床结局。宫腔内灌注rhCG可刺激子宫内膜分泌与着床密切相关的细胞因子，将两者联合起来，在增加宫腔内着床相关因子浓度的同时有效抑制子宫收缩,对RIF的患者不失为一种改善其妊娠结局的尝试方法,但其疗效尚需大样本量的试验和更多设计良好的前瞻性随机试验来证实。
参考文献
1 Margalioth EJ,Ben-Chetrit A,Gal M,et al.Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET.Hum Reprod.2006,21:3036-3043.
2 Pierzynski P.Oxytocin and vasopressin V (1A) receptors as new therapeutic targets in assisted reproduction.Reprod Biomed Online,2011,22:9-16.
3 Chou PY,Wu MH,Pan HA,et al.Use of an oxytocin antagonist in in vitro fertilization-embryo transfer for women with repeated implantation failure:a retrospective study.Taiwan J Obstet Gynecol,2011,50:136-140.
4 Mansour R,Tawab N,Kamal O,et al.Intrauterine injection of human chorionic gonadotropin before embryo transfer significantly improves the implantation and pregnancy rates in in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection:a prospective randomized study.Fertil Steril,2011,96:1370-1374.
5 Gardner DK,Lane M,Stevens J,et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome:toward a single blastocyst transfer.Fertil Steril.2000,73:1155-1158.
6 Coughlan C,Ledger W,Wang Q,et al.Recurrent implantation failure:definition and management .Reprod Biomed Online,2014,28:14-38.
7 Pierzynski P,Reinheimer TM,Kuczynski W.Oxytocin antagonists may improve infertility treatment.Fertil Steril,2007,88:213,e19-e22.
8 Zhu L,Yanping LY,Xu A.Influence of controlled ovarian hyper-stimulation on uterine peristalsis in infertile women.Hum Reprod,2012,27:2684-2689.
9 Pierzynski P,Gajda B,Smorag Z,et al.Effect of atosiban on rabbit embryo development and human sperm motility.Fertil Steril,2007,87:1147-1152.
10 Lan VT,Khang VN,Nhu GH,et al.Atosiban improves implantation and pregnancy rates in patients with repeated implantation failure.Reprod Biomed Online,2012,25:254-260.
11 张玥，褚玉晶，罗海宁,等.阿托西班用于反复植入失败者行解冻胚胎移植的临床效果观察.中国计划生育学杂志,2014,22:325-328.
12 Kapiteijn K,Koolwijk P,van derWeiden RM,et al.Human embryo-conditioned medium stimulates in vitro endometrial angiogenesis.Fertil Steril,2006,85:1232-1239.
13 Emiliani S,Delbaere A,Devreker F,et al.Embryo-maternal interactive factors regulating the implantation process：implications in assisted reproductive.Reprod Biomed Online,2005,10:527-540.
14 Banerjee P,Fazleabas AT.Endometrial responses to embryonic signals in the primate.Int J Dev Biol,2010,54:295-302.
15 Rosen AM,Hermoso MC,Cook-Andersen H,et al.Purification of human chorionic gonadotropin (hCG) for intra uterine injection.Fertil Steril,2013,99:s8.
16 Santibanez A,García J,Pashkova O,et al.Effect of intrauterine injection of human chorionic gonadotropin before embryo transfer on clinical pregnancy rates fromin vitrofertilization cycles:a prospective study.Reprod Biol Endocrinol,2014,12:9.
17 文娅,李予,倪仁敏,等.宫腔灌注绒毛膜促性腺激素对反复着床失败后冻融胚胎移植妊娠结局的作用.生殖与避孕,2015,35:91-94.