人类辅助生殖技术中，如何获得高质量的胚胎进行移植以获得理想的临床结局，一直是生殖医学工作者不懈努力的目标。研究表明，精卵孵化时间过长产生高水平活性氧(ROS)可独立诱导DNA损伤，不但破坏精子膜的流动性和完整性，还可导致DNA单链形成或双链断裂[1-2]，从而影响人类辅助生殖技术的妊娠结局 [3-4]。当精子DNA损伤小于8%时，卵子具有修复DNA损伤的能力，超过这个范围将影响胚胎的发育潜能，导致胚胎发育停止、流产和胎儿畸形等[5-6]。然而，精卵孵育时间的长短是否对围产儿健康状况产生影响未见报道。本研究探讨精卵共孵育时间对妊娠结局及围产儿健康状况的影响，以期为提高人类辅助生殖技术的效率及安全性提供依据。
对象与方法
一、对象
选择2013年1月—2014年12月在广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心行常规体外受精的3 323例患者，共3 368个取卵周期，随机分成精卵孵育时间缩短组和传统受精组：孵育时间缩短组1 968例患者，共1 996个取卵周期，患者年龄范围为20～46岁，平均(32.3±4.7)岁，获卵数范围为1～46枚，平均获卵(12.2±7.3)枚；传统受精时间组1 355例患者，共1 372个取卵周期，传统受精方式，精卵过夜孵育16～18h，患者年龄范围为20～46岁，平均(32.4±4.5)岁，获卵数范围为1～53枚，平均获卵(12.2±7.53)枚，比较两组的年龄及获卵数，无统计学差异(P>0.05)。
二、方法
1. 控制性超排卵：采用本中心常规促性腺激素释放激素激动剂(gonadotrophin-releasing hormone agonist, GnRHa)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)促排卵方案。阴道B超和激素测定监测卵泡生长，当1个优势卵泡直径≥18 mm或2个优势卵泡≥17 mm时肌注HCG 10 000 IU，34～36 h后阴道B超引导下穿刺取卵。
2.精液采集及处理：丈夫禁欲3～7 d，以手淫法收集当天新鲜精液，采用密度梯度离心法洗涤，后通过上游制作受精滴。根据卵子数目做成数个100μl授精滴(每受精滴可加入卵子3～8个)，置37℃、5%CO2，培养箱中平衡。
3.受精：取卵后3～4 h(HCG后39～40 h)把卵子加到预先制作的受精滴中，孵育时间缩短组精卵孵育3～4 h将卵子转移至新鲜的已平衡过的受精培养滴中；传统受精组，精卵孵育过夜16～18h。两组均于受精后16～18 h,采用机械的方法去除颗粒细胞，清洗后转入卵裂培养液中，观察受精情况。
4.胚胎评分及囊胚培养：参照文献[7]方法,胚胎培养第三天(D3)根据卵裂球形态、大小及碎片量、卵裂球空间分布、胞浆均质情况等进行形态学评分，根据胚胎的情况及病人的条件确定是卵裂期胚胎移植还是囊胚移植。
5.临床妊娠观察：胚胎移植后第14d检测尿、血hCG阳性者为生化妊娠，移植后4～6周B超见宫内妊娠囊为临床妊娠。
6.评价指标及计算公式：两组间胚胎发育情况比较采用成熟率(MⅡ卵数/总获卵数×100%)、正常受精率(正常受精卵数/总获卵数×100%)、多精受精率(多精受精卵数/总获卵数×100%)、冷冻率(有胚胎冷冻的周期/总取卵周期×100%)、优胚率(总优质胚胎数/总正常受精胚胎数×100%)、囊胚率(总囊胚形成数/行囊胚培养的胚胎数×100%)、胚胎利用率(可利用的胚胎数/总正常受精胚胎数×100%)等指标进行评价；妊娠结局采用生化妊娠率(生化妊娠周期数/移植周期数×100%)、临床妊娠率(临床妊娠周期数/移植周期数×100%)、种植率(孕囊数目/移植的胚胎数目×100%)、流产率(流产周期数/临床妊娠周期数×100%)、异位妊娠率(异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%)等指标进行评价；新生儿健康状况采用移植周期活产率(活产分娩数/移植周期数×100%)、低出生体重儿率(低出生体重儿分娩数/活产分娩数×100%)和极低出生体重儿率(极低出生体重儿分娩数/活产分娩数×100%)等指标进行评价。
7.统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行分析。比较两组的胚胎发育情况、妊娠结局及新生儿健康状况。计量资料以
表示，采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、胚胎发育情况的比较
精卵孵育时间缩短组和传统受精组的成熟率分别为76.1%、76.9%，多精受精率分别为6.8%、6.9%，冷冻率分别为72.9%、71.1%，差异均无统计学意义(P>0.05)。孵育时间缩短组的正常受精率、优胚率、囊胚率及胚胎利用率分别为70.1%、49.7%、46.0%、52.1%，高于传统受精组(分别为68.2%、48.4%、30.3%、50.9%)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 两组胚胎发育情况的比较[%(例)]
注：*两组比较，P<0.05
二、临床妊娠结局的比较
精卵孵育时间缩短组的生化妊娠率(54.6%) 、临床妊娠率(49.2%)、种植率(37.5%)及移植周期活产率(38.9%)与传统受精时间组(51.2%、45.5%、35.0%、 37.4%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，多胎妊娠率、单卵双胎率、流产率、异位妊娠率、死胎/死产率，两组比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表2。
三、新生儿结局的比较
精卵孵育时间缩短组共分娩740个婴儿，其中单胎分娩544个婴儿，双胎分娩196个婴儿。传统受精组共分娩477个婴儿，其中单胎分娩349个婴儿，双胎分娩128个婴儿。两组新生儿按照胎数进行分层比较，结果显示无论单胎还是双胎，两组在孕周、出生体重、低出生体重儿和极低出生体重儿发生率、身长、Apgar评分及出生畸形率上，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表2 两组临床妊娠结局的比较
表3 两组新生儿出生结局的比较
讨 论
人类辅助生殖技术已跨入以高效、安全为主题的时代，关于子代的安全性的问题受到更多的关注。已有较多的研究表明，缩短精卵相互作用的时间可明显提高胚胎的质量[8-10]。但关于精卵孵育时间长短对新生儿健康状况的研究未见报道。
近年来有研究发现，卵子与高密度精子长时间作用，精子代谢产物堆积，不仅消耗培养液的能量，而且驱散的颗粒细胞及死精子等都可使卵细胞处于一个营养不良的环境中[11]。短时受精缩短了卵子暴露于过量代谢产物中的时间，在一定程度上起到了改善胚胎质量的作用，且短时受精后卵子周围会剩余1～3层的颗粒细胞，可作为共培养细胞，可分泌一些对早期胚胎发育有利的物质和去除培养环境中对早期胚胎发育不利的物质[8]。Enkhmaa等[12]分别检测了精卵共孵育4h与18h后授精培养液中活性氧ROS的浓度，结果表明，缩短精卵共孵育时间，ROS浓度降低，胚胎质量也有显著改善。当精液质量差时，常合并附睾性腺炎症，造成内细胞增多，精子活力下降及活性氧增多，从而对胚胎质量的影响更严重[13]。本研究结果显示精卵孵育时间缩短组的正常受精率高于传统受精时间组，且优胚率、囊胚率及胚胎利用率均高于传统受精时间组。因此本研究表明，缩短精卵孵育时间有效胚胎的发育潜能及胚胎的利用效率，与Kattera[9]、Bungum等[10]的研究结果一致，缩短精卵孵育时间更符合人类自然生理状况，是一种简便有效的受精方式。
目前对于缩短精卵孵育时间是否影响临床妊娠结局，仍存在着争论。屈宗银等研究[14-15]认为短时受精可改善妊娠结局。代谢产物产生的有害物质，加速透明带硬化，故缩短精卵孵育时间可防止透明带过早硬化，使囊胚易于孵出，提高了胚胎植入率。但也有报道发现短时受精并不影响临床结局[16-17]。这可能与各IVF实验室的技术方法、精卵共孵育时所加的精子量、研究设计及病例选择等不同有关。本研究表明，精卵孵育时间缩短组的生化妊娠率、临床妊娠率、种植率及活产率均稍高于传统受精时间组，但差异无统计学意义，而多胎妊娠率、单卵双胎率、流产率、异位妊娠率、死胎/死产率均无统计学差异。因此，关于缩短精卵孵育时间是否改善临床结局，其结论还需要更多研究数据来证明。
目前关于精卵孵化时间对新生儿结局的研究报道颇为匮乏。精卵共孵育过程中产生活性氧(ROS)等有害物质造成精子的DNA损伤，从而影响妊娠结局[18]。Benchaib[6]等研究发现精子DNA 损伤可导致受精失败、胚胎发育停止、流产和胎儿畸形等。缩短精卵孵育时间可以使卵子尽早脱离高活性氧、高DNA损伤精子的环境，那么由于孵育时间过长所造成的一定程度精子DNA损伤是否与新生儿健康状况相关值得深入探讨。本研究中两组的单胎和双胎在孕周、出生体重、低出生体重儿和极低出生体重儿发生率、身长、评分上差异也无统计学意义，两组婴儿出生畸形率亦无明显差异，故本研究结果说明孵育时间不影响子代的安全性，但需大样本量进一步加强对新生儿健康状况的综合评价，以充分评估精卵孵化时间对助孕后子代的长远影响。
总之，IVF-ET总是致力于为病人提供最优质的胚胎用于移植，选择缩短精卵孵育时间可以优化IVF受精方法，能有效提高胚胎的发育潜能及胚胎的利用效率，而对新生儿未见明显影响。关于缩短精卵孵育时间是否改善新生儿结局，其结论还需更大样本量的研究来论证。
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