神经管缺陷(neural tube defects，NTDs)是在胚胎发育早期神经管闭合不全引起的一组缺陷[1]。我国是出生缺陷高发国家，2014年山西省NTDs患病率达31.5/万[2]。NTDs由环境和遗传因素共同引起[3]，遗传因素占50%以上[4]。平面细胞极化信号通路(PCP通路)基因突变与神经管缺陷的关联近年来受到较大关注[5]。Scribble/Scrib基因是PCP通路相关基因。研究发现，Scrib插入突变使小鼠产生卷尾表型[6]。Robinson等[7]及Lei等[8]分别在颅脊柱裂和脊柱裂患者中检测到SCRIB基因的突变。然而，既往研究均以血液为标本，缺乏对病变处组织突变情况及是否存在体细胞突变的研究。
体细胞突变(somatic mutation)指生物体内除生殖细胞外的体细胞发生的突变，不从父母遗传获得，只发生在子代特定器官组织中，不造成后代遗传改变[9]。体细胞突变理论最早应用于肿瘤领域，随着生物技术的提高，逐步应用于神经系统[10]、心脏[11]和肾脏疾病[12]等疾病的病因解释。目前国内外尚没有NTDs与体细胞突变关系的研究。本研究选取了中枢神经系统病变处组织和脐带组织，将二代测序技术与Sanger法测序结合，旨在筛选SCRIB基因体细胞突变，同时选取来自不同胚层的多个器官组织，探讨突变分布情况，为NTDs的发病机制提供新的思路。
对象与方法
一、对象
本研究的研究对象募集自山西省平定、泽州、昔阳、寿阳、太谷5个县[13]。样本收集时间为2011年3月—2011年11月。纳入条件为：产前诊断引产的NTDs的胎儿；母亲为山西省常住居民(在本地居住2年以上)，且本次妊娠期间在本地居住；汉族人群；胎儿不合并其他系统缺陷；同意参加研究并签署书面知情同意书。排除条件包括：母亲患有慢性疾病如糖尿病、癫痫等；母亲患有严重妊娠合并症如妊娠期高血压、先兆子痫等；最近1个月服用药物如抗癫痫药物等；胎儿病变类型不明确的及病变部位不明确的。本研究第一步纳入28名患儿筛选NTDs相关的SCRIB突变位点，然后纳入另一组51例患儿进行验证测序。本研究已经过北京大学生物医学伦理委员会审批。
样本来自同一患儿的病变处组织和正常对照组织，引产胎儿排出2 h内，病理科医生按照尸体解剖操作规范，对引产胎儿进行尸体解剖，无菌条件下取材，主要取胎儿脊柱病变处、脑组织病变处，同时取表皮、心脏、肾、胸腺、肝等正常组织，收集保存胎儿胎盘和脐带组织。
二、方法
1. DNA提取：在4℃环境下取患儿的病变处、皮肤、心脏、肌肉、胸腺、肺和脐带组织25 mg，按QIAamp DNA Mini Kit tissue试剂盒操作流程提取组织DNA；采用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)检测DNA浓度，于-80℃保存DNA。
2. PGM测序：将提取出的DNA跑电泳检测其降解程度，如无降解，将基因组稀释至5 ng/μl。采用Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0试剂盒建立样品文库、连接接头和纯化DNA文库。采用Ion PGM Hi-Q OT2 Kit试剂盒，在Ion OneTouchTM2 System仪器上进行油包水反应。在Ion OneTouch ES仪上富集阳性模板，并收集待测样品。采用Ion PGM Hi-Q Sequencing Kit、Ion PGM Wash 2 Bottle Kit及Ion 318TM Chip Kit v2 BC (8 rxns)试剂盒在318TM芯片上进行测序，测序结果采用PGM平台自带的Torrent SuiteTM Software软件进行结果初筛，并上传至Life tech 公司的Ion Reporter数据分析平台进行测序结果多重分析。
3. Sanger测序：以目标位点上下游各300 bp为目标基因片段，使用NCBI/Primer-BLAST在线工具设计PCR引物，其序列为：1-上游引物：5’-CCCCAGATCCTCACCCTCATA-3’，1-下游引物：3’- CCCAACGCCTGCTGACTGT-5’； 2-上游引物：5’-GCTGACACCAACCTTGACAG-3’，2-下游引物：3’-CCTCACCCTTTTGTCCGCA-5’。PCR反应容积为50 nl，每一反应体系中含2×Taq PCR Green Mix 25 μl，ddH2O 15 μl，上、下游引物各2 μl，模板DNA 6 μl(20 ng/μl)。PCR反应程序：94 ℃ 12 min(94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s)37个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ hold。将产物送往北京三博远志公司进行sanger测序。
4.数据分析：参考dbSNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、千人基因组数据库(www.1000genome.org)和ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)数据库，确认检测到的突变是否为新发突变。采用SIFT在线预测工具(http://sift.jcvi.org/)及PolyPhen2软件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)预测突变对蛋白质功能的影响。采用Clustal-Omega 1.2.1软件估计突变位点编码的蛋白质物种间保守性。采用Mutation Surveyor 4.0.8软件，将Sanger测序结果与NCBI数据库参考序列做比对。将病变组织检测到而正常组织未检测到的突变定义为体细胞突变[14]，由于脐带是胚胎发育过程中胎儿最早发育的组织，将其作为正常对照组织。
结 果
一、PGM测序结果及突变功能预测
对28名NTDs患儿的病变处进行PGM测序，分别在编号为A6和A2的患儿病变处检测到SCRIB基因的2个突变位点(c.1931G>C和c.1265C>T)，本次测序覆盖度均达到97%以上，平均测序深度均达到300以上。如图1所示，A6测序深度达721.8，覆盖率达97.29%；A2测序深度为457.3，覆盖率达98.83%，测序结果良好。
图1 PGM测序覆盖率和测序深度图
与参考数据库对比，c.1931G>C和c.1265C>T位点均不是新发突变。运用SIFT和PolyPhen2进行突变功能预测，c.1931G>C突变不影响蛋白功能，为良性突变；c.1265C>T影响蛋白功能，为有害突变，见表1。保守性估计结果见图2，突变位点c.1931G>C编码的蛋白质在人、狗、小鼠、大鼠等哺乳动物中具有保守性；c.1265C>T突变位点编码的蛋白质在人与狗中具有高度保守性。
表1 28名患儿PGM测序结果
注：突变率表示检测到突变位点的次数占所有检测次数的百分比。SIFT功能预测评分<0.05表示该突变影响蛋白功能；>0.05该突变不影响蛋白功能。Polyphen评分0.957～1为有害；0.453～0.956可能有害；0～0.452无害
二、Sanger法验证病变处及其他组织中突变情况
取A6和A2患儿的脐带，同时取外胚层的皮肤，中胚层的心脏和肌肉、内胚层的胸腺和肺，对其进行Sanger法测序。在A6患儿病变处检测到c.1931G>C突变，在脐带组织中未检测到突变，在皮肤、心脏、肌肉、胸腺和肺组织中均检测到c.1931G>C突变。在A2患儿的病变处检测到c.1265C>T突变，而在脐带、皮肤、心脏、肌肉、胸腺和肺组织中均未检测到该突变。A2与A6病变处的突变(c.1931G>C和c.1265C>T)均不由父母遗传而来，为体细胞突变，见图3。
图2 SCRIB基因两个突变位点的保守性估计
图3 体细胞突变的样本的Sanger测序结果
三、扩大样本量研究
另外纳入51名NTDs患儿，采用Sanger法，在其病变组织中针对PGM测序筛选出的突变位点进行验证测序。在51名患儿病变处中均未检测到c.1931G>C突变；在51名患者中，有5名患者病变处检测到c.1265C>T突变，进一步对该5名患者的其他组织进行测序，在其他组织中均检测到c.1265C>T突变，且不同胚层之间突变情况一致，提示该5名的c.1265C>T突变可能由父母遗传而来，见表2。
表2 扩大样本量验证结果
注：EN脑膨出；SB脊柱裂
讨 论
本研究以SCRIB基因为目标基因，在第一阶段的28名NTDs患儿中检测到2个体细胞突变位点(c.1931G>C和c.1265C>T)。在51例NTDs患儿中验证测序检测到5例c.1265C>T突变病例。本研究提示NTDs的发生与SCRIB基因突变有关联，尤其是SCRIB基因的体细胞突变。
平面细胞极化信号通路(PCP通路)，最先在果蝇翅膀远端体毛中发现[15]。对于哺乳动物建立和维持细胞极化方向起重要作用[16]。当前已有多项动物模型和人群测序表明PCP通路相关基因与NTDs的发生有关[1]。SCRIB基因是PCP通路相关基因，其调控细胞质多模块支架蛋白，对于上皮组织极化有重要作用[17]。Scrib1基因突变导致小鼠卷尾，其和Vangl2基因在功能上存在交叉[18]。Robinson等[7]通过对36名颅脊柱裂患儿测序，在其中2名患儿中分别检测到2个杂合突变(c.1360C>T和c.4604G>A)，其中c.4604G>A为有害突变。Lei等[8]192里脊柱裂患儿中检测到3个SCRIB有害突变(c.3128C>T、c.3995C>T和c.4995T>G)，其突变蛋白均胞质定位异常，提示SCRIB基因为神经管缺陷的病因之一。然而，既往研究均注重于检测血液中的突变情况，病变组织是否存在同样突变，缺乏研究数据。患儿的突变可能遗传自父母，也可能为新发突变。由于绝大多数神经管缺陷患儿的父母均表型正常，因此，患儿新发突变致病，特别是体细胞突变的可能是存在的。
同一个机体的病变组织有突变而其他正常组织无突变，提示为体细胞突变[19]。当前已经发现体细胞突变在肿瘤及神经系统等疾病的发生中具有重要作用。Muotri等[10]发现，人类L1元件可以导致小鼠神经干细胞产生体细胞突变，从而影响神经元连接，导致神经系统疾病。神经管缺陷作为严重的神经系统发育性疾病，本研究推测体细胞突变可能在NTDs的发生过程中起到一定作用。
本研究在2例患儿病变组织中分别检测到SCRIB基因的2个突变(c.1931G>C和c.1265C>T)而在其脐带中未检测到该突变，提示该两个突变为体细胞突变。其中c.1931G>C为良性突变，不影响蛋白功能，而c.1265C>T为有害突变，影响蛋白功能的表达。保守性估计结果表明，以上突变位点在哺乳动物中保守，对于哺乳动物有重要作用。同时，对于其他胚层的皮肤、肌肉、胸腺、肺和心脏组织测序，该组织中均存在c.1931G>C突变，而未检测到c.1265C>T突变，提示以上两个体细胞突变发生部位和时期不同。在扩大的样本量病变组织中均未检测到c.1931G>C突变，有5例患儿病变处检测到c.1265C>T突变，但是该突变在同样患儿的脐带和其他组织中也均检测到，提示突变来自父母。本研究共纳入79例NTDs患儿，其中1例发生c.1931G>C体细胞突变，突变发生率为1.26%，明显大于参考数据库中亚洲人群该位点突变发生率(0.19%)，另1例发生c.1265C>T体细胞突变。同时有5例在病变处和脐带均发生了c.1265C>T突变，提示为种系突变，该位点突变频率小于亚洲人群发生频率，提示为基因多态性变异。结合SCRIB基因在神经管形成过程中调控细胞极化的重要作用，本研究结果提示，SCRIB基因的体细胞突变可能与NTDs发生有关。
本研究采用了PGM测序和Sanger法结合的方式进行测序。PGM测序为二代测序，利用了半导体芯片技术，可针对目标基因进行靶向测序，灵敏度较Sanger测序大大增加，并可大规模同时精确测序[20]。本次PGM测序结果覆盖度均达到97%以上，平均测序深度均达到300以上，表明测序良好。
本研究首次探讨了NTDs患者的不同组织突变情况，在NTDs患儿中检测到SCRIB基因的体细胞突变，为NTDs遗传学机制提供新的思路。但是本研究仅在人群中进行了验证，新发的突变位点对于神经管缺陷发生发展机制的研究，以及其是否和PCP通路其他基因之间存在交互作用，有待进一步实验进行验证。
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