肌源干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)存在于肌纤维的肌膜与基板之间，多处于静息期，在肌肉组织损伤并需要修复时大量增殖，它维持着肌肉组织的自我更新[1]。经研究发现，MDSCs在一定条件下可分化为骨骼肌细胞、平滑肌细胞[2]、甚至神经细胞[3]。MDSCs作为种子细胞，已用于压力性尿失禁[4]、杜氏肌营养不良[5]、心肌疾病[6]等较多疾病的治疗研究。本研究的目的就是体外培养MDSCs并初步探讨其成肌特性，为以后的基因治疗和组织工程奠定基础。
对象与方法
1.对象：新生3～5 d的SD乳鼠(中山大学动物实验中心提供)，DMEM/F12培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(天津TBD公司)，Dispase酶(Roche公司)，Cardiac troponin T抗体(Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、明胶、胶原酶I、DAPI、乙酰胆碱、α-银环蛇毒素试剂购于Sigma公司，PBS平衡液、结蛋白(desmin)单克隆抗体、骨骼肌肌球蛋白(skeletal myosin)抗体购于博士德公司。
生长培养基(DMEM/F12+20%FBS)、分化培养基(DMEM/F12+5%FBS)。
2.MDSCs的分离、纯化和培养：新生3～5 d的SD乳鼠，于无菌条件下取后肢骨骼肌，放在0.1 mol PBS液中，解剖显微镜下剔除筋膜、肌腱、血管和脂肪组织。将肌组织块用PBS冲洗3遍，用解剖剪将组织块剪成1 mm3大小，移入离心管中，再用PBS反复吹打3次，静置1 min后，弃去上层液体和漂浮组织。按每克肌肉2 ml混合消化酶(Dispase 2.4 U/ml，0.2% collagenase，2.5 mmol/L CaCl2)进行消化，37 ℃，1 h，加5倍体积的DFl2+20% FBS终止消化，反复吹打后经200目的不锈钢滤网过滤，离心，重悬。
反复差速贴壁法(preplate)纯化MDSCs：将细胞悬液吸入经明胶包被的培养瓶中培养2 h，贴壁的细胞为PPl(preplate1)；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养24 h，贴壁的细胞为PP2 (preplate2)；未贴壁的细胞悬液再转入另一培养瓶中培养24 h，贴壁的细胞为PP3(preplate3)；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养24 h，贴壁的细胞为PP4(preplate4)，供进一步细胞鉴定和分化实验用。
原代培养第1天首次换液，以后每3天换液一次。当细胞达70%～80%融合，换用分化培养基继续培养，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及肌管自发性收缩现象。
3.MDSCs的鉴定：将生长状态较好的细胞经消化后种于爬片上，第2天取出爬片；PBS小心冲洗3遍；1%Triton X-100/4%PFA固定、破膜30 min；PBS冲洗3遍；正常山羊血清(1∶10)封闭30 min；加一抗desmin(小鼠抗人，1∶100)，4 ℃过夜；PBS冲洗3遍：加TR标记的二抗(山羊抗小鼠，1∶100)，室温避光保湿孵育1 h；PBS冲洗3遍；DAPI复染核15 min；PBS洗3遍，过双蒸水1遍：适量缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照。
4.肌管的Skeletal myosin、cardiac troponin T免疫荧光鉴定：六孔板中生长状态较好的肌管，吸干废液；PBS小心冲洗3遍；1%Triton X-100/4%PFA固定、破膜30 min；PBS冲洗3遍；正常山羊血清(1∶10)封闭30 min；加一抗skeletal myosin(小鼠抗兔，1∶100)或cardiac troponin T(小鼠抗大鼠，1∶200)，4 ℃过夜；PBS冲洗3遍；加TR标记的二抗(山羊抗小鼠，1∶100)，室温避光保湿孵育1 h；PBS冲洗3遍；DAPI复染核15 min；PBS冲洗3遍，过双蒸水一遍；适量缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照。
5.肌管乙酰胆碱受体的鉴定：α-银环蛇毒素试剂已与荧光染料罗丹明结合,可在荧光显微镜下发红光。原试剂浓度为100 μmol/L，用分化培养基配制成终浓度为10 nmol/L供实验用。乙酰胆碱为粉末状，用分化培养基配制成终浓度为10 nmol/L供实验用。将培养4 d的肌管吸去培养基，分化培养基洗3遍,实验组加入配好的银环蛇毒素，37℃孵育60 min；对照组加入配好的乙酰胆碱30 min，分化培养基洗3遍后，再加入配好的银环蛇毒素，37℃孵育60 min；实验组和对照组吸去银环蛇毒素，PBS洗3遍；4%PFA固定20 min；PBS洗3遍；超纯水洗1遍；缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照。
6.统计学处理：用SPSS 16.0进行统计分析，PP2、PP3、PP4得到的单位视野MDSCs阳性率的两两比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.MDSCs的纯化和培养：倒置相差显微镜下观察，混合酶消化后，刚接种的细胞呈圆形，折光性强。PP1、PP2细胞贴壁迅速，细胞数量多，生长迅速，PP3、PP4细胞数量逐渐减少，细胞折光性强，贴壁缓慢，PP4用生长培养基培养1天，细胞形态逐渐变成梭形，隔3天换液一次，待细胞生长至70%～80%后传代。培养第二代的细胞增殖到70%～80%时，加入分化培养基，培养第4天，形成粗大的肌管，可见多个细胞核排列在肌管的中央，培养第6天，逐渐沿一个方向平行排列，部分肌管相互交织形成网状结构(图1)。
A.培养1天的PP1；B.培养1天的PP2；C.培养1天的PP3；D.培养1天的PP4；E.PP2培养6天分化成的肌管；F.PP3培养6天分化成的肌管；G.PP4培养6天分化成的肌管 图1 混合酶消化法和preplate分离纯化的MDSCs及分化成的肌管(bar=100um)
2.MDSCs的鉴定：Desmin是肌肉特异性的中间丝蛋白，是最早表达于活化的肌源性干细胞的蛋白之一，存在于骨骼肌、心肌及平滑肌细胞的胞浆中，在维持肌细胞的形态和功能方面起着重要的作用，也是国内外研究者鉴定MDSCs最常用的指标[7-8]。图2A显示经Desmin免疫荧光检测，MDSCs呈阳性反应为红色，DAPI染细胞核呈蓝色，20倍物镜下随机数20个视野的细胞，PP4中Desmin阳性反应的细胞约占90%。单位视野PP2、PP3、PP4的阳性细胞率分别为29.3%(454/1 550)、75.5%(657/870)、89.6%(448/500)，差异有统计学意义。
3.肌管的鉴定：Skeletal myosin为骨骼肌特有的功能蛋白，是肌卫星细胞分化形成肌管和成熟骨骼肌的标志。Cardiac troponin T是心脏特有的心肌蛋白，是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩调节蛋白。主要调节心肌收缩过程中粗、细肌丝之间的相对滑行，近几年来被用于鉴定间充质干细胞分化为心肌样细胞的标志[9]。乙酰胆碱受体(AchRs)是骨骼肌发育过程中最早出现的膜蛋白。AchRs在肌纤维表面高浓度聚集表达被认为是分化为成熟骨骼肌纤维的标志，并伴随着AchRs电生理的变化[10]。α-银环蛇毒素特异性与神经肌肉接头的N-AchR结合，阻断Ach作用于乙酰胆碱受体，因此，可被用来鉴定骨骼肌细胞的乙酰胆碱受体。肌管经skeletal myosin和Cardiac troponin T免疫荧光染色呈阳性为红色，DAPI染细胞核呈蓝色(见图2B、图2C)。图3显示在培养第4天MDSCs分化为肌管后，用α-银环蛇毒素-罗丹明染色后,在肌管表面呈红色聚集成簇的乙酰胆碱受体表达，但在预先用乙酰胆碱孵育后，由于AchRs已与乙酰胆碱结合,再用α-银环蛇毒素-罗丹明来染色，未见呈红色团块状聚集的乙酰胆碱受体的表达。
讨论
长期以来，肌组织的正常发育和修复全部归功于肌卫星细胞，但这一结论被分离得到的一类多能干细胞打破，这类细胞被称为侧群干细胞。Bhagavati等[11]从肌组织中分离得到侧群干细胞，将其注射到经过致死剂量射线照射后的小鼠血管内，发现此类细胞可以持续增殖并分化为几乎所有类型的血细胞，证实了其自我更新和多潜能分化的能力，因而也被赋予MDSCs的名称。对于肌卫星细胞的培养，受到的关注和研究较多，而MDSCs的培养在国内较少见。因此，本研究拟在体外培养乳鼠肌源干细胞，并探讨其成肌分化的能力，为今后的细胞移植或基因治疗提供种子细胞。
Dispase酶是一种中性蛋白酶，与分离细胞常用的胰酶相比，对细胞损害小，且它可以消化细胞外基质，有利于干细胞的释放[12-13]。Qu-Petersen等[12]用胶原酶、Dispase酶、胰蛋白酶逐步消化从而分离MDSCs。与之不同，本实验利用胶原酶、Dispase酶混合消化，简化了操作步骤，且未使用胰蛋白酶，从而减少了对细胞的损伤。目前最常用的MDSCs纯化方法主要有preplate[12]、密度梯度离心法[14]、流式细胞术、免疫磁珠法。Preplate即反复差速贴壁法，是根据成纤维细胞贴壁速度快，而MDSCs贴壁速度慢的特点,将成纤维细胞去除,提高MDSCs的纯度。本实验用此方法纯化，得到的PP3、PP4从细胞形态上看可描述为两类，一类颇似肌卫星细胞的短梭形，一类为小圆形。这与Qu-Petersen等[12]对肌源干细胞形态描述颇为相似。
MDSCs几乎没有特异性表面标志物，国内外大部分实验室检测Desmin(肌源性标志物)对其进行鉴定，本研究发现反复差速贴壁到PP4时，经Desmin鉴定纯度达到近90%。
肌管形成是MDSCs成肌分化的标志，本实验中除形态上的变化外，肌管同时表达了骨骼肌特异性蛋白Skeletal myosin、心肌特异性蛋白Cardiac troponin和骨骼肌的膜蛋白AchRs。Skeletal myosin和AchRs的表达说明MDSCs已向着成熟骨骼肌纤维分化，AchRs表达的鉴定在国内外的研究中较少见。有大量研究将Cardiac troponin作为嗅球[15]、骨髓[16]、脂肪等来源的间充质干细胞分化为心肌样细胞的鉴定，本研究将其用于鉴定MDSCs成肌分化的一个标志，为以后的心肌疾病的细胞治疗打下基础。
肌管的自发性收缩现象，目前国内外均有报道，但对于这种现象产生的原因没有定论。赵科研等[17]在收缩的细胞中加入终浓度为0.1 μmol/L的异丙肾上腺素(isoproterenol，IP)，结果发现加入IP后细胞收缩频率比加入前平均增加约18.4次/分钟，说明肌源干细胞表面可能有ß受体的存在。本试验在肌管培养过程中，也发现了肌管有自发性收缩现象。
综上所述，本实验采用混合酶消化法和preplate分离纯化，成功地获得了具有成肌分化能力的MDSCs，为骨骼肌疾病、心肌疾病、泌尿系统疾病的细胞治疗奠定了基础。
(图2、图3见封底)
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