PI3K/Akt/eNOS信号通路与胚胎植入和妊娠维持

不孕不育是21世纪危害人类生殖健康的重要疾病之一，世界范围内育龄期夫妇不孕不育症发病率约10%～15%[1]，我国育龄女性不孕症发病率为7%-10%[2]。随着二胎政策的放开，越来越多的高龄妇女寻求生育帮助，但是人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)周期平均成功率约40%[3]。子宫内膜容受性是影响其成功率的重要因素，也是国际相关研究的焦点难点问题。子宫内膜容受性[4]是指子宫内膜在特定时期内允许胚胎着床的能力，胚胎着床是胚胎在子宫内膜定位、黏附、侵入等复杂生理过程。PI3K/Akt/eNOS是一条广泛存在于细胞中的经典信号通路，通过磷酸化或去磷酸化在体内多个方面发挥重要作用，尤其在血管生成方面。血管生成是体内一个非常重要的过程，它的正常进行有助于胚胎侵入，实现血管重铸，保证妊娠的顺利进行[5-6]。PI3K/Akt/eNOS通路可能参与调控这一过程。因此，本文探讨PI3K/Akt/eNOS通路对胚胎植入和妊娠维持的作用，以期为改善子宫内膜容受性、提高ART成功率的临床和科学研究提供新思路。

一、PI3K/Akt/eNOS通路

PI3K/Akt/eNOS是位于内皮细胞具有重要调控作用的信号转导通路。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)是由P110催化亚基和P85调节亚基组成的异源二聚体，是一种具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性的胞内磷脂酰肌醇激酶。雌激素、血管内皮生长因子、胰岛素等信号分子与细胞表面相应受体结合能够将胞内PI3K激活，被激活的PI3K在质膜上磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)产生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)。PIP3与胞内信号蛋白丝或苏氨酸蛋白激酶/蛋白激酶B(Akt/PKB)的PH结构域和PDK1(phosphoinositi dependent kinase-1)结合，促使PDK1磷酸化Akt[7]，活化的Akt又能够激活分布于血管内皮的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)从而释放具有扩血管作用的一氧化氮(nitric oxide,NO)。

PI3K具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶活性，是由催化亚基p110和一个调节亚基p85构成的二聚体蛋白。根据p110结构特点和底物分子的不同可将PI3K其分为I型、II型、III型3个亚型。其中，I型PI3K被广泛研究。p85亚基与蛋白激酶C、Ras蛋白等激活蛋白发生相互作用，激活p110亚基，从而活化PI3K[8]。被活化的PI3K通过磷酸化产生PIP3[9]。

Akt是PIP3下游主要分子之一。PIP3与Akt氨基末端的PH结构域结合后，Akt的构象发生改变并且Thr308和Ser473磷酸化位点被暴露[10-11]。激酶域的Thr308和调节域的Ser473是Akt磷酸化发生的两个特殊位点，其中Ser473磷酸化位点是Akt活化所必需的位点之一。Akt通过磷酸化和去磷酸化调节其活性。活化的Akt 通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白的表达。

eNOS是Akt已知的下游底物之一，活化的Akt 可促进eNOS蛋白表达。eNOS是一氧化氮合酶同工酶的一种，多分布于血管内皮，催化左旋精氨酸(L-arginine)产生NO，NO具有扩血管、增加血管通透性的作用。eNOS蛋白表达增加或丝氨酸残基磷酸化可使eNOS活性上升。eNOS主要有Ser116、Thr495、Ser11773个磷酸化位点，其中Thr495磷酸化减弱eNOS活性，Ser1177磷酸化增强eNOS活性[12]。Ser1177位于eNOS羧基端的还原酶区，Ser1177磷酸化后使羧基端自抑控制区失活，还原酶区到氧化酶区电子流增强，eNOS的解离活化，从而使eNOS的活性提高[13]。

二、PI3K/Akt/eNOS通路与血管生成

血管生成是指从已经存在的毛细血管和毛细血管后微静脉形成新的毛细血管，主要包括激活血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网等过程。PI3K/Akt/eNOS通路能够通过动员内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)、产生NO等方式，在血管生成以及血管修复中起到重要作用[14]。

PI3K/Akt/eNOS通路能够动员EPCs促进血管再生和内皮修复。EPCs又称为血管内皮干细胞，能够归巢于缺血部位，并参与血管的生理性和病理性重建[15]。陈永存[16]研究显示阿托伐他汀可能通过激活PI3K/Akt/eNOS信号转导途径增加单侧输尿管梗阻小鼠肾间质管周微血管密度，亦可通过该通路动员EPCs促进微血管再生，延缓肾间质纤维化的发生。秦臻等[17]发现当归补血汤具有他汀类药物的作用，通过PI3K/Akt/eNOS通路促进EPCs增殖、黏附、迁移，从而增殖、迁移、分化、替代、更新并修复受损动脉血管内皮细胞。徐寒松等[18]研究证实黄芪多糖能够增强Akt-Ser473、eNOS-Ser1177磷酸化蛋白的表达，通过PI3K/Akt/eNOS信号途径增加EPCs的数量、促进其增殖分化，改善血管内皮的修复力，促进血管生成和重建。Nana Yang等[19]发现一定剂量的载脂蛋白模拟肽反转D-4F能够通过PI3K/Akt/eNOS信号通路，促进EPCs的增殖、迁移、血管生成，从而有利于阻止动脉粥样硬化的发展进行。

活化的Akt可使eNOS磷酸化并激活，活化的eNOS产生NO，PI3K/Akt/eNOS通路主要通过产生NO发挥促进血管生成作用。NO是高活性的自由基，它作为信号分子参与机体正常生理功能的调节，如舒张平滑肌细胞、抑制血小板活化、促进血管再生和增加血管通透性等。王东彬等[20]研究发现肾上腺髓质素(ADM)通过影响VEGF激活PI3K/Akt/eNOS通路，也可以直接激活PI3K/Akt/eNOS信号转导通路，参与肾肿瘤血管生成。赵婷[21]发现分别用Akt上游抑制剂Akt inhibitor Ⅳ、PI3K抑制剂LY294002以及eNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)后，人的异位子宫内膜间质细胞中SLIT2的表达较单纯应用雌激素组均下降，说明雌激素可能是通过PI3K/Akt/eNOS信号通路诱导异位子宫内膜间质细胞中SLIT2的表达，从而促进新生血管生成，利于异位子宫内膜侵入。Shuzhen Li等[22]发现决明子素降血压的机制可能与其激活内皮的PI3K/Akt/eNOS通路有关，调节NO的产生和内皮的完整性，促进血管扩张，终而达到降血压的作用。

可见，PI3K/Akt/eNOS通路在体内发挥促血管生成作用，通过动员EPCs增殖、迁移、促管腔形成，以促进血管生成和修复；主要通过产生NO，扩张血管、增加血管通透性，促进血管生成。

三、血管生成在胚胎植入和妊娠维持中的作用

血管生成是体内许多生理病理改变的基础。胚胎植入过程中，滋养细胞侵入子宫螺旋小动脉，代替血管内皮，扩张螺旋动脉，使植入部位血流增加，子宫内膜迅速蜕膜化。这一过程有赖于血管生成的正常进行，最终发生血管重铸，保证胚胎植入和妊娠维持[5,23]。

胚胎血管系统形成发育通过血管发生和血管生成两种方式。妊娠早期主要通过血管生成的方式产生，中胚层间充质细胞侵入到绒毛间质[24]，原始毛细血管融合形成血管网，并连接到胚胎血管。胚胎血管系统形成在子宫内膜蜕膜化过程中具有重要作用，也是胚胎植入和维持妊娠状态的必要环节。血管生成的动态平衡通过促血管生成因子和抑制血管生成因子的调节控制[25-27]，促血管生成因子产生增多或者抑制血管生成因子产生不足时，促血管生成因子占优势，引起血管生成。促进血管生成的因子有血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、NO、白细胞介素等；抑制血管内皮生成的因子有内皮抑素(endostatin，ES)、血管抑素(angiostatin)。

VEGF是一种肝素血管生长因子，是特异性促进血管内皮细胞有丝分裂和血管生成最重要的细胞因子。VEGF与其特异性受体VEGFR结合产生生物效应：促进内皮细胞增殖；内皮细胞迁移；管腔形成；增加血管通透性；基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)等基因表达；单核细胞、巨噬细胞迁移。VEGF的这些生物效应有助于血管生成，在胚胎植入和妊娠维持中具有重要作用，其异常表达与妊娠期高血压疾病、胎儿宫内生长受限、流产、子痫等妊娠疾病有关[28-29]。研究发现，受精第5天胚胎植入局部VEGF高表达，提示VEGF促进血管生成和毛细血管网的建立，改善子宫内膜容受性[30]，促进胚胎植入[31-32]。Rowe等[31]用原位杂交技术检测妊娠狨猴子宫内膜，发现VEGFmRNA在腺上皮持续存在于妊娠期，说明VEGF对妊娠的维持有重要作用。VEGF表达不足时，胚胎着床部位血管生成减少，早期绒毛生成不良，出现流产等[33]。王珺等[5]对38例不明原因早期复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)绒毛组织中VEGF进行检测，发现其VEGF表达较正常妊娠绒毛组织低。说明在母胎界面，低表达的VEGF使绒毛组织中新生血管内皮细胞的生成和螺旋小动脉的侵入障碍，胚胎缺血缺氧，终而导致RSA。

NO作为内源性血管扩张剂，使着床部位血管扩张和血管通透性增加；另外，NO还可以激活平滑肌中的糖皮质激素，使cGMP产生增多，增多的cGMP促进内质网摄入钙离子并减少胞浆中的钙离子，从而使平滑肌松弛[35]，这些都为胚胎植入和妊娠维持提供保障。黄睿等[34]还通过向小鼠腹腔内注射NOS非特异性竞争抑制剂L-NAME，发现L-NAME能竞争性抑制NOS从而抑制NO的产生，影响胚胎着床，说明NO在胚胎着床过程中起着重要的作用，这种作用可能是通过促进子宫内膜血管通透性增加和胚胎发育而实现的。NO促进植入期子宫内膜蜕膜化，子宫内膜蜕膜化是子宫内膜为胚胎植入做准备，表现为子宫内膜进一步增厚、血供丰富、腺体分泌旺盛、基质细胞肥大、含有丰富的糖原和脂滴。Ota等[36]发现抑制NO表达会延迟基质细胞蜕膜化，蜕膜细胞功能异常，严重影响胚胎植入。

MMPs是一类具有降解细胞外基质的蛋白水解酶，在妊娠的各个时期发挥重要作用，VEGF和NO都可以促进其表达与活化。在胚胎植入期，细胞外间质组织被滋养层细胞组织产生的MMP降解，胚胎滋养组织侵入。但是过多的MMPs就会引起子宫内膜异位症[38]、胚胎过度植入而对伤害母体。NO还可以抑制子宫内膜自然杀伤细胞(uterine nature killer cell，uNK细胞)的细胞毒效应。uNK细胞是子宫内膜间质中表型为CD56bright的一群特殊细胞，直接细胞毒性弱，在分泌期和妊娠早期表达快速增加，通过分泌细胞因子和表面抗体对胚胎着床植入进行调节。

四、雌激素通路和滋养细胞分化

在胚胎植入过程中，滋养细胞彼此融合，形成多核滋养细胞层，即合体滋养细胞层。合体滋养细胞层具有侵蚀性，能够对子宫内膜进行初级侵袭[23]。雌激素为卵巢类固醇激素，其与孕激素相互协调调控胚胎植入和妊娠维持[39]。雌激素能够与细胞表面雌激素受体结合，激活PI3K/Akt/eNOS信号通路，产生NO促进血管生成与修复[40]。有实验[41]观察体外细胞滋养细胞向合体滋养细胞分化过程，用eNOS抗体对eNOS进行免疫组化染色，发现合体滋养细胞阳性，而细胞滋养细胞阴性，说明eNOS产生的NO与细胞滋养细胞向合体滋养细胞分化有关。经过初级侵袭后，合体滋养细胞改变其功能和表型。细胞滋养层细胞进行分化，形成长绒毛深入子宫内膜和子宫肌层，形成绒毛外滋养层细胞[23]。部分绒毛外滋养层细胞形成血管滋养细胞，具有侵入子宫螺旋动脉代替母体内皮细胞的作用，扩张螺旋动脉，终而实现血管重铸。

五、PI3K/Akt/eNOS通路在子宫内膜容受性中的价值与意义

子宫内膜容受性是影响ART成功率的重要因素，如何提高子宫内膜容受性是ART技术研究的热点与难点。PI3K/Akt/eNOS是一条经典信号通路，通过磷酸化或去磷酸化激活分布于血管内皮的下游分子eNOS。eNOS是NO合成的限速酶，NO作为内源性血管扩张剂，具有舒张平滑肌细胞、抑制血小板活化、促进血管再生和增加血管通透性等作用。PI3K/Akt/eNOS通路能够通过动员内皮祖细胞、产生NO等方式，尤其以产生NO为主要方式促进血管生成。血管生成为胚胎滋养细胞侵入螺旋小动脉、扩张螺旋动脉、形成毛细血管网提供基础，实现血管重铸，对提高子宫内膜容受性，增加胚胎植入部位血流，以及胚胎植入后妊娠的维持，都起着非常重要的作用。另外，PI3K/Akt/eNOS还促进胚胎滋养细胞的分化。

由此可见，PI3K/Akt/eNOS信号转导通路可以通过促进子宫内膜基质层血管的生成和血管通透性的增加，有利于胚胎滋养细胞植入子宫内膜，为保证妊娠过程的进行提供足够的血液供应，并促进胚胎滋养细胞的分化。本文对PI3K/Akt/eNOS通路对胚胎植入和妊娠的维持进行综述，以期为改善子宫内膜容受性[37]、提高ART成功率的临床和科学研究提供新的研究角度与思路。

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