宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，死亡率仅次于乳腺癌，严重威胁着女性的健康[1]。放射治疗作为宫颈癌的主要治疗方法，适用于各期宫颈癌。目前，约80%的宫颈癌患者把放疗作为单纯治疗或综合治疗的手段之一，其疗效也得到国际上的一致认可[2-3]。但在接受放射治疗的宫颈癌患者中，仍有约13%的患者出现了局部复发[2]。而放疗增敏是解决上述问题的重要策略之一。然而,目前包括物理增敏(如加温、超短微波等)和化学增敏(如metronidazon化学增敏剂)等在内的增敏手段均因缺乏肿瘤靶向性而难以达到最佳疗效[4-6]。因此，发展安全、高效的新型靶向基因治疗药物以增强放疗敏感性，降低放疗剂量，减少其副作用成为改善宫颈癌后的重要治疗策略之一。
细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)作为一种新型的药物递送工具也备受关注。CPPs是一类不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽，具有跨膜转运能力，能够携带外源性大分子进入细胞，且在一定浓度范围内对宿主细胞无毒害作用[7]。本实验前期研究发现,肿瘤靶向性穿膜肽R11作为药物递送载体，在肿瘤细胞中起到转运多肽片段的效果。目前，已证实细胞穿膜肽R11作为一种新型靶向药物递送系统，可携带多肽片段靶向进入肿瘤细胞并发挥生物学作用[8]。
DAB2IP(DOC-2/DAB2interactive protein)是最近发现的Ras-鸟苷三磷酸酶激活蛋白(Ras GTPase activating protein，Ras-GAP)家族的新成员，作为一种新型抑癌基因,在多种肿瘤细胞中表达缺失[9-12]。DAB2IP表达主要受表观遗传调节,被证实具有调节细胞凋亡、抑制血管生成、抑制肿瘤侵袭转移等复杂功能[9,13-14]。近年来研究发现，DAB2IP不仅和肿瘤发生发展密切相关，同时也在肿瘤放疗耐受中发挥着重要的作用[15-18]。PR结构域是DAB2IP的重要潜在结构域之一，参与包括ASK1-JNK信号通路、PI3K-AKT信号通路及NF-kB途径等细胞内信号通路的调节[19-21]。最近有研究表明，该区域含有一个10个脯氨酸重复序列(P10，aa796-805)，能够与含有SH3的结构域结合[19]。DAB2IP的PR结构域可通过P10多肽片段直接参与细胞内通路调节，从而在肿瘤细胞调控中发挥重要作用[19]。因此，研究P10多肽片段在宫颈癌放疗增敏过程中的作用及其机制具有重大科学意义和应用价值。本实验旨在利用R11携带P10多肽片段进入宫颈癌细胞并发挥生物学作用。
材料和方法
1.细胞培养：人宫颈癌细胞株Siha购自ATCC公司，Siha细胞培养于 DMEM 培养液( Dulbecco′s Modified Eagle Medium,High Glucose,GlutaMAXTM，厂家：GIbco,货号：10566016)中加入 5%的小牛血清(Newborn Calf Serum,Heat Inactivated,New Zealand Origin,厂家：GIbco,货号：2601006)，置于37°C、5%CO2培养箱中。
2.多肽的制备：细胞穿膜肽R11-P10(RRRRRRRRRRR-PPPPPPPPPP),R11-Control(RRRRRRRRRRR-NPRSAKRPPN)利用多肽合成仪(货号：10135201；规格：25 mL Reaction Vessel；公司Advanced Automated Peptide Protein Technologies)合成、HPLC纯化及鉴定。多肽由西安交通大学材料学院郭翔教授帮助合成并馈赠。
3.多肽在细胞内摄取检测：将细胞以1×105的密度铺在带有玻片的12孔板中培养24 h；同时，将用羧基荧光素FAM标记的多肽FAM-P10、R11-P10-FAM(R11-P10)和R11-Control-FAM(R11-Control)分别5 uM添加到细胞中孵育2 h，接着将转染后细胞置于无血清培养基DMEM中清洗3遍。为了获得更精确的定量结果，使用流式细胞术检测宫颈癌细胞内的FAM表达水平。
4.克隆形成实验测定细胞存活率：取对数生长期Siha细胞，胰酶消化后按1 000、5 000、10 000、20 000个/孔将细胞种植于6 cm培养皿中。每种密度设置3个对照孔。将细胞置于CO2培养箱中，将细胞给予DMSO、R11-Control(10 μM)、R11-P10(10 μM)孵育4 h后给予不同剂量UV照射。处理后细胞置于培养箱中培养14 d后福尔马林固定，结晶紫染色，统计细胞集落数(通常将>50个以上细胞克隆记为一个细胞集落)。细胞存活率(Survival fraction,SF)公式为SF(%)=(S/S0)×100%,其中S为UV照射细胞克隆形成率，S0为对照细胞克隆形成率。
5.流式细胞仪检测细胞周期：取对数生长期的Siha细胞，DMSO及5 uM的多肽片段FAM-P10、R11-P10-FAM和R11-Control-FAM处理Siha细胞2 h后，用PBS洗涤三次，胰酶消化后制成5×106/L细胞悬液，用75%冰冷的乙醇重悬细胞,4℃固定24 h。将固定后细胞离心后弃上清，用 PBS 清洗细胞3次，弃上清后加入200 μl RNase A，37℃孵育30 min，冰浴10 min,中止 RNA 酶的催化反应。用 PBS 清洗细胞 2 次,洗去 RNA 酶。加入 500 μl 碘化丙啶(PI)染色液染色(50 μg/ml)重悬细胞，混匀后 4℃ 避光染色 30 min。上机进行流式细胞仪分析
6.Westernblot：收集细胞样本，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。4℃离心机离心弃去沉淀，收集蛋白后BCA法定量分析蛋白浓度。
制备10% SDS-PAGE胶，上样于泳道后100 V恒压分离后转PVDF膜，接着在PBS/Tween-20中用5%脱脂牛奶封闭2 h，加鼠抗人单克隆FAM抗体(Cell Signaling Technology，USA) ,羊抗人单克隆p-AKT,AKT抗体(Cell Signaling Technology，USA)和鼠抗人β-actin 单克隆抗体( sc-130756，Santa Cruz) 4℃过夜。加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、兔抗羊抗体(sc-130656,Santa Cruz) ，室温孵育1 h 洗膜后显影。用BandScan图像分析系统扫描图像的光密度，以各组目的蛋白条带光密度值与内参蛋白( β-actin) 光密度值计算相对比值。
7.统计学处理：采用 SPSS16.0 软件，两组数据比较采用 Student＇s t 检验，多组间资料比较采用 One-way ANOVA 单因素方差分析( LSD 法) 。P<0.05 为差异有统计学意义。
结果
1.多肽片段的细胞内摄取情况：首先，为检测多肽在宫颈癌细胞中是否存在肿瘤靶向性，合成FAM标记P10后，在流式细胞仪下观察P10在宫颈癌细胞内的摄取情况。如图1所示，相较于DMSO对照组，R11-Control组及R11-P10组在细胞内荧光强度存在显著差异，差异有统计学意义。
注：FAM标记的多肽片段5 uM作用于Siha细胞2 h后PBS漂洗3遍，流式细胞仪记录细胞内多肽片段荧光强度(左侧)，同时柱状图定量荧光强度(右侧)
图1 多肽片段的细胞内摄入
2.在宫颈癌细胞中的放疗增敏作用：为检测R11-P10颗粒是否能在宫颈癌细胞中发挥放疗增敏作用，利用克隆生存实验检测Siha细胞中的放疗增敏情况，如图2所示，相较于DMSO对照组及R11-Control组，R11-P10多肽对宫颈癌Siha细胞放疗敏感性存在显著差异，差异有统计学意义。
3.R11-P10对宫颈癌细胞Siha细胞周期的影响：R11-P10对细胞周期的影响见图3，与对照组R11-DMSO、R11-Control组相比，Siha细胞G2期由 23.1%上升至 48.8%，差异具有统计学意义，而对照组变化不显著。
图2 细胞生存曲线检测多肽对Siha细胞的放疗增敏作用
图3 流式细胞仪检测不同各浓度(0μM、1μM、5μM、10μM)多肽预处理Siha细胞后对细胞周期的影响
4.R11-P10对可抑制p-AKT蛋白表达影响：如图4所示，R11可携带FAM标记的多肽进入Siha细胞。相较于对照组R11-DMSO、R11-Control组，R11-P10处理后的Siha细胞株接受放疗后，p-Akt蛋白水平与对照组相比差异存在统计学意义，而总AKT及p-ERK变化不显著(图4)。
讨论
宫颈癌是严重威胁女性健康的一种疾病，基因治疗为人类治疗多种恶性肿瘤奠定了基础。近年来，CPPs作为基因治疗中非病毒载体在研究领域备受瞩目。理想的基因治疗载体是使目的基因可靶向、高效、可控的表达。R11细胞穿膜肽可靶向介导外源性分子，包括蛋白、多肽片段、microRNA等进行肿瘤细胞跨膜转运，尽管目前其可能机制尚不清楚，但该转运体系已越来越多的应用于肿瘤细胞的体内外靶向药物研究中。本研究在前期研究中曾构建R11携带P53功能片段在膀胱癌中发挥靶向抗肿瘤作用，但在宫颈癌细胞中是否存在高摄取仍未有相关研究。本研究实验中利用生物素FAM标记多肽片段后流式细胞仪监测细胞内生物素水平，用来评价细胞内多肽摄入水平。如图1所示，相较于对照组，R11可有效携带多肽进入Siha 细胞。但多肽摄取直接证据仍待进一步研究。
图4 Western-Blot 检测多肽及其对照多肽+/-IR处理后p-AKT、AKT、ERK、蛋白表达变化
提高宫颈癌放疗敏感性是提高肿瘤疗效，改善宫颈癌预后的关键问题之一。近年来研究发现，DAB2IP在肿瘤放疗耐受中发挥着重要的作用。如，在前列腺癌中，DAB2IP下调可导致肿瘤放化疗耐受，过表达DAB2IP可增强肿瘤放疗敏感性[16,22]；KONG等证实DAB2IP缺失可能通过增强DSB的修复、G2-M期检查和抵抗凋亡引发前列腺癌细胞耐受放疗的能力增强[15]；在膀胱癌中，ATM(ataxia-telangiectasia mutated)抑制剂可通过抑制ATM磷酸化，抑制肿瘤细胞内DNA损伤修复，增强DAB2IP缺失肿瘤细胞对放疗的敏感性[18]。这些结果都提示DAB2IP是治疗肿瘤放疗耐受的有效靶点。然而DAB2IP调控肿瘤放疗敏感性的具体机制尚不清楚。PR结构域作为DAB2IP的重要功能片段调控包括AKT通路在内的多种信号通路的调控，有可能在肿瘤放疗中发挥重要作用。本研究发现与单放组、及放疗联合对照多肽组相比，放疗联合R11-P10组形成克隆的能力明显下降，说明R11-P10有显著放疗增敏作用。本研究中P10相较于对照组，R11-P10作用组细胞周期显示出明显的G2/M期阻滞。现已有大量研究证明，对放射最敏感的是 M 期细胞，G2 期细胞也较敏感,G1早期细胞相对敏感，随着 G1逐步向 S 期发展,放射敏感性随之降低，至 G1 后期已呈现出相对抗性，S 期细胞对放射呈明显的抗性。故G2期细胞阻滞可使肿瘤细胞对放疗敏感性增加[23]。
AKT及其下游信号通路与多种肿瘤细胞生物学作用相关。活化的AKT即p-AKT可以通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能。Akt还能通过激活 mTOR或FOXO1等信号通路调节细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞的生长、增殖，增加肿瘤对化疗和放疗的抵抗[24]。本实验western-blot结果显示，相比对照组，P10联合放射组可相对抑制p-Akt的表达，说明P10可能是通过对AKT通路的抑制进一步诱导凋亡发挥对Siha细胞的放射增敏作用。
综上所述，R11作为新型的非病毒载体可携带P10进入宫颈癌Siha细胞并发挥肿瘤增敏作用。P10能显著降低该细胞中p-AKT蛋白的表达水平,改变该细胞的周期分布，出现G2/M期阻滞，这可能是P10基因放射增敏作用的机制。
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