国家“十三五”规划纲要要求将耳聋等遗传性疾病列入出生缺陷综合防控方案，并建立涵盖孕前、孕期和新生儿各阶段的出生缺陷防治免费服务制度[1]。目前耳聋基因筛查研究的报告人群主要集中在耳聋患者、正常孕期人群和新生儿，孕前耳聋基因筛查检测中国人遗传性耳聋常见基因突变热点是实现这一目标的关键所在[2-3]。筛查方法多采用耳聋基因芯片检测与先天性耳聋、药物性耳聋和大前庭导水管综合征相关的4个耳聋基因中的9个位点，有的研究还涉及了其他一些基因和位点以及扩增技术，如wolframin基因(WFS1)、G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(GPRASP2)、线粒体tRNASer(UCN)等基因研究以及多重置换扩增(MDA)和单核苷酸多态分型(SNPscan)等技术研究[4-10]。本文仅对耳聋基因芯片检测结果判读和生育风险等问题进行探讨。
一、芯片检测结果判读
1.检测基因和位点：孕前耳聋基因筛查采用遗传性耳聋基因检测芯片，检测4个常见耳聋基因中的9个位点，包括GJB2基因c.35 del G、c.176 del 16、c.235 del C、c.299 del AT，GJB3基因c.538 C>T，SLC26A4基因c.2168 A>G、IVS7-2 A>G和线粒体12S rRNA基因1494 C>T、1555 A>G。
2.芯片探针和排列：芯片采用多重等位基因特异性PCR结合通用芯片的技术进行高通量平行检测，芯片的微量点样技术是将各位点检测探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，检测探针各重复5个点，质控探针各重复5、10或15个点，形成11行×15列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列，每一个微阵列可以检测一份样本。每张芯片能测4份样本，见图1。对于每份样本，芯片设置了QC(表面化学质控探针)、PC(杂交阳性对照探针)、BC(空白对照探针)、NC(阴性对照探针)、IC(各基因扩增内部质控探针)以及9个检测位点的W(野生型)和M(突变型)探针。这9个位点为(1)35 del G(芯片示意图中为“35”)；(2)l76 del 16(芯片示意图中为“176”)；(3)235 del C(芯片示意图中为“35”)；(4)299 del AT(芯片示意图中为“299”)；(5)538 C>T(芯片示意图中为“538”)；(6)2168 A>G(芯片示意图中为“2168”)；(7)IVS7-2 A>G(芯片示意图中为“IVS”)；(8)1494 C>T(芯片示意图中为“1494”)；(9)1555 A>G(芯片示意图中为“1555”)[11]。
耳聋基因芯片检测过程包括核酸提取、多重PCR扩增、杂交、洗涤和扫描等操作流程，最后获得检测结果报告[12-13]。
3.结果显示和判读：遗传性耳聋基因检测芯片判别系统自动判读扫描结果，位点检测探针W阳性，判读该位点为野生型(两条等位基因上该位点均未发生突变)，探针M阳性，该位点为纯合突变型(该位点两条等位基因均发生突变)；若探针W和M均阳性，则为杂合突变型(该位点有一条等位基因发生突变)。对于线粒体12S rRNA基因突变位点，若M阳性为均质突变型，表示线粒体12S rRNA基因上该位点均发生突变；M和W两者同为阳性，则为异质突变，该位点部分发生了突变。以235 del C位点检测结果为例，可能出现3种情况，即235 del C野生型、235 del C纯合突变型和235 del C杂合突变型，见图2[13-14]。
二、基因解读提示
1.GJB2基因：GJB2定位于13q11-12，DNA全长4804bp，含两个外显子，其编码区位于第二外显子，长678bp，编码含226个氨基酸的连接蛋白(Connexin26，Cx26)，这种蛋白负责细胞间信号传导和离子传递，在人类的耳蜗毛细胞中高度表达，突变的GJB2产生异常的蛋白，干扰细胞间信息传递功能[15]。GJB2基因与DFNB1的表型相关，以轻度至极重度的语前感音神经性听力损失为多见，亦可表现进行性听力损害[16]。近几年的研究证明，GJB2在柯替氏器的发育中很重要。GJB2的缺失可导致内耳柯替氏器的发育缺陷，并引起外耳毛细胞的畸形退化[17-18]。GJB2敲减较早的小鼠出现柯替氏器的畸形，而敲减较晚的小鼠柯替氏器发育正常，说明内耳柯替氏器的发育缺陷发生在听力发生之前[19]。GJB2缺失可能削弱了耳蜗主动性放大而导致了晚发型听力损失[20]。耳聋基因芯片检测结果是GJB2 杂合突变型，为遗传性耳聋GJB2基因突变携带者，如果是GJB2纯合突变型或复合杂合突变型，则提示为遗传性耳聋患者，这些检测结果的被检者亲属需要进行基因检测，以确认其是否为遗传性耳聋患者或GJB2基因突变携带者。
图1 芯片设计示意图
图2 235 del C 位点检测结果图
2.GJB3基因：GJB3定位于人类染色体1p33-35，编码有270个氨基酸的连接蛋白31，DNA全长3617bP。GJB2基因编码的间隙连接蛋白31(Connexin31，Cx31)，是间隙连接蛋白家族中的一员[15]。Cx31突变可以导致常染色体显性或隐性听力下降、周围神经疾病伴听力丧失，以及变性红皮肤病角化病，导致不同疾病的机理一直是研究的重点。通过突变体研究分别证实Cx31的两个显性变性红皮肤病角化病(EKV)突变(G12R和G12D)能够表达至细胞质膜并形成间隙连接通道。另有研究证实4个EKV突变(G12R，G12D，R42P和C86S)不能运输至细胞质膜，因而不能形成间隙连接通道。还有研究发现Cx31的隐性EKV突变L34P表达的蛋白质不能运输至细胞表面形成间隙连接通道，从而导致L34P蛋白积累在细胞质内[21]。其后通过GJB3基因结构特征及生物信息学分析显示，Cx31的保守性低于Cx26，突变对Cx31的影响小于Cx26，这是GJB2突变致聋人群远多于GJB3突变的原因之一[22]。耳聋基因芯片检测结果是GJB3杂合突变型，为遗传性耳聋GJB3基因突变携带者，应该注意后天高频听力损失。
3.SLC26A4基因：又称为PDS基因，定位于人类染色体7q31，其mRNA全长4930bp，含21个外显子，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin，SLC26A4的突变几乎分布于所有的外显子和侧翼序列[15]。SLC26A4基因与DFNB4表型相关，呈进行性或波动性症状，一般可以发展至极重度听力损失，累及所有频率[12]。SLC26A4基因编码的Pendrin蛋白主要由疏水性氨基酸组成，能够介导细胞碳酸氢钠离子、氯离子和碘离子等的交换。研究表明，Pendrin蛋白表达于内淋巴管和内淋巴囊上皮细胞及椭圆囊和球囊边缘的神经细胞中，发生异常时可影响细胞内外阴离子的转运，从而影响声音传递导致听力损失。内耳的Pendrin蛋白表达缺失会引起一些继发性病变[23-25]。甲状腺病变与耳聋具有相关性[26]。耳聋基因芯片检测结果是SLC26A4杂合突变型，为遗传性耳聋SLC26A4基因突变携带者，应建议被检者亲属进行基因检测。检测结果是SLC26A4纯合突变型或复合杂合突变型，提示为遗传性耳聋患者，建议进行影像学检查，以便确诊是否为大前庭导水管综合征，还要避免头部外伤和注意甲状腺情况。
4.线粒体12S rRNA基因：线粒体DNA(mtDNA)是人细胞质中唯一的DNA分子，是独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码的功能，但同时受到核DNA的调控。线粒体遗传属于母系遗传，DNA突变与氨基糖苷类药物致聋和非综合征性耳聋有关[15]。mtDNA 12S rRNA基因上常见的两个突变位点1555 A>G和1494 C>T是导致听力损失的一个主要原因，而核修饰基因、线粒体单体群和氨基糖苷类药物等其他修饰因子调节1555 A>G和1494 C>T突变的表现型[27]。耳聋基因芯片检测结果是12S rRNA均质或异质突变型，提示为药物耳聋敏感性个体，建议被检者及母系家族成员终生禁用耳毒性药物。
三、生育风险分析
孕前耳聋基因检测可以在分子水平明确病因预防耳聋发生，从基因角度向被检者进行耳聋原因分析，介绍预防和治疗遗传性耳聋的方法，评估家族和下一代发生遗传性耳聋的风险。孕前检查需要对各种不同的人群作出生育风险分析。(1)夫妇双方听力正常，无家族遗传史。(2)夫妇中一人患有耳聋，伴有家族遗传史。(3)夫妇双方均患有耳聋，伴有家族遗传史。(4)夫妇双方听力正常，但其中一方伴有家族遗传史。(5)夫妇双方听力正常，无家族遗传史，但生育过耳聋子女[28]。其中(1)为孕前耳聋基因筛查一般人群，(2)～(5)为孕前耳聋基因筛查高危人群[2]。
1.孕前耳聋基因筛查一般人群：耳聋基因芯片检测结果均是野生型，提示9个遗传性耳聋基因位点无突变，发生遗传性耳聋的概率较小。
2.正常夫妇后代患耳聋的生育风险分析：(1)通过耳聋基因检测，如果夫妇一方是线粒体DNA A1555G突变携带者，而另外一方耳聋基因检测是野生型，那么当男方是线粒体DNA A1555G突变携带者时，由于线粒体疾病遵循母系遗传方式，所以男方的突变是不会传给子女，子女与其他正常夫妇的后代耳聋的概率是相同的。如果女方为基因突变携带者，子女将不分性别，都会是基因突变的携带者，子女只要终生避免接触氨基糖苷类抗生素药物就可以预防耳聋的发生。(2)夫妇一方为GJB2或SLC26A4基因突变携带者，而另一方为相同基因突变的携带者，就是夫妇同为GJB2或SLC26A4基因突变的携带者，子女将有25%的耳聋风险。这样的夫妇可以在生育前进行产前诊断来判断胎儿的基因型，防止聋儿出生。(3)男方是GJB2基因突变携带者，而女方是SLC26A4基因突变携带者，夫妇两人所携带的突变基因型不一样，子女将有50%的概率成为GJB2或(和)SLC26A4基因突变携带者，但不会发生GJB2或SLC26A4基因突变耳聋。
3.夫妇中有一人耳聋的生育风险分析：(1)常染色体显性遗传致聋，在患者中所占比例较低(15%～24%)，因纯合子罕见，子代约有1/2的概率为患者，表现型(发病时间和耳聋程度)因不同致病基因有所差异。(2)常染色体隐性遗传致聋，为最普遍的遗传性耳聋遗传形式，在患者中所占比例高(75%～85%)，子女全部为表现型正常的携带者。(3)X连锁遗传致聋，在患者中比例低(1%～2%)，隐性遗传患者为女方时，儿子发病几率高，女儿为表现型正常的携带者；患者为男方时，儿子正常，女儿为表现型正常的携带者。(4)Y连锁遗传致聋，少见，儿子发病机率高[28]。
4.耳聋夫妇的生育风险分析：(1)夫妇双方均为环境因素致聋时，子女患耳聋的概率比较低，与正常夫妇后代患耳聋的概率相同。(2)夫妇一方为环境因素致聋，另一方为遗传因素致聋时，子女患耳聋的概率为2%～3%、较正常夫妇后代患耳聋高50～100倍，子女100%为突变基因携带者。(3)夫妇双方均为GJB2突变致聋时，子女患耳聋的几率为100%。(4)夫妇双方均为SLC26A4突变致聋时，子女患耳聋的几率为100%。(5)夫妇一方为GJB2突变致聋，另一方为SLC26A4突变致聋时，子女耳聋发病率较低，约2%～3%，子女均为GJB2和SLC26A4基因突变携带者。
5.已生育聋儿家庭(家族)的生育风险分析：(1)聋儿检测到SLC26A4或GJB2两个基因突变，且两个突变分别来自父亲和母亲，则该聋儿的父母再生育时会有25%的几率生育聋儿，在怀孕12～26周行产前基因诊断，可以预测胎儿的听力状况。该聋儿今后的配偶也应进行SLC26A4或GJB2基因突变检测，避免生育耳聋后代。此外，与该聋儿父母有血缘关系的所有亲属均有可能携带SLC26A4或GJB2基因突变，有生育耳聋后代的风险，对与该聋儿的父母有血缘关系的亲属本人及其配偶进行SLC26A4或GJB2基因检测和遗传咨询指导，有助于尽早发现危险因素，避免生育耳聋后代[29]。(2)聋儿经过耳聋基因检测，发现是线粒体DNA A1555G突变者，其发病与使用耳毒性(氨基糖苷类)药物密切相关，此遗传性耳聋遵循母系遗传方式，所以母亲及其所有后代和母系家庭成员均为线粒体DNA A1555G突变携带者，都应该终生禁止使用氨基糖苷类药物，以防止耳聋的发生[13]。
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