地中海贫血是由于一种或多种珠蛋白肽链合成受阻或抑制，导致血红蛋白组分异常，从而引起的溶血性贫血，是一种遗传性溶血性疾病[1]。根据合成障碍肽链的不同，主要分为α地中海贫血和β地中海贫血两大类。世界上不同国家发病率大约在1%～10%，在地中海地区某些国家发病率高达10%[2,3]。在中国，华南地区如广东、广西等地中海贫血高发，而佛山也为地中海贫血高发区域之一。为避免或减少再次出生中间型和重型地中海贫血，及早发现和治疗地中海贫血患儿，本中心从去年开始开展全市地中海贫血筛查。为探讨本地区地中海贫血筛查及基因型分布情况，以及Hb Bart's 带含量对α-地中海贫血分型的价值，现对本市2016年1月—2016年9月的地中海贫血筛查及基因确诊情况报道如下。
对象与方法
1.研究对象
于2016年1月—2016年9月，以佛山市妇幼保健网为平台，募集在广东省佛山市各产科医院出生的新生儿，采集新生儿足底末梢血，用血红蛋白电泳法做初筛检测。基本募集条件如下：(1)佛山市四区(禅城区、南海区、三水区和高明区)出生。(2)新生儿家属知情同意。
经血红蛋白电泳法初筛阳性者，我们将其召回。召回复检的新生儿经家属知情同意后，采集新生儿静脉血做地中海贫血基因检测以确诊。
2.方法
(1)主要实验仪器和试剂
Capillarys2全自动毛细管电泳仪(法国Sebia公司)；缓冲液、溶血素、冲洗液和正常HbA2质控品等(法国Sebia公司)；PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司，icycler)；α地贫基因检测试剂盒和β地贫基因检测试剂盒(深圳亚能生物技术有限公司)；DNA快速提取试剂盒(康宁生命科学有限公司)。
(2)标本采集和保存
采血时间为新生儿出生后2～7 d。采集血片标本前，护士向家长解读新生儿疾病筛查告知书并经家属知情同意，且完整填写采血卡片，按照采血规范进行操作。采集新生儿足底末梢血，滴在滤纸片上，血片采集完成后，于4 ℃冰箱保存。初筛阳性者召回做基因检测者，抽取新生儿静脉血2 ml 于EDTA抗凝管中，于4 ℃冰箱保存。
(3)全自动血红蛋白电泳检测方法
采集的血片经打孔制成试验用直径为3.2 mm的血斑，用蒸馏水浸泡血斑后，须于2～72 h内用全自动毛细管电泳仪上机检测。首先，读取样品架及样品试管的条形码，然后用溶血素稀释样本，每次稀释后要清洗取样针，再清洗毛细管，稀释后的样本注入毛细管，然后在稳定恒压下进行电泳，在415 nm波长下检测血红蛋白(Hb)各组分百分比。HbA2带和部分Hb Bart's带须手动识别。
(4)地中海贫血的基因诊断方法
采用DNA快速提取试剂盒提取全血DNA后，在PCR扩增仪上扩增，α地贫基因采用α地贫基因检测试剂盒，β地贫基因采用β地贫基因检测试剂盒，按照操作说明书进行。缺失型α地贫基因采用Gap-PCR技术法检测，非缺失型α地贫基因和β地贫基因采用反向斑点杂交技术法(RDB)检测。
(5)诊断标准和定义
①初筛阳性
出现Hb Bart's带，即为初筛α地中海贫血阳性。出现HbE带即初筛β地中海贫血阳性，或者根据HbA带、HbA2带及HbA/HbA2比值综合判定是否为初筛β地中海贫血阳性。
②确诊阳性
-α4.2/αα、-α3.7/αα、αCSα/αα、αWSα/αα和αQSα/αα为静止型α地中海贫血， -α3.7/-α3.7、-α3.7/αQSα、--SEA/αα为轻型α地中海贫血，-α4.2/--SEA、--SEA/αCSα、--SEA/αWSα、-α3.7/--SEA为中间型α地中海贫血，--SEA/--SEA为Hb Bart's 水肿。
-28/N、-29/N、IVS-II-654/N、βE/N、CD41-42/N、CD17/N、CD71-72/N、CD43/N、CD14-15/N、CD27-28/N为轻型β地中海贫血。
-α3.7/αα & CD17/N、--SEA/αα & CD41-42/N、-α3.7/αα & IVS-II-654/N、-α3.7/αα & CD41-42/N和-α3.7/αα & βE/N为α合并β轻型地中海贫血。
(6)统计分析方法
采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料用频数和率表示。
结果
1.新生儿人群基本特征
2016年1月—2016年9月募集在佛山市出生的新生儿共28 491名，经血红蛋白电泳法初筛阳性者3 824名,初筛阳性率13.4%。我们对初筛阳性者进行召回，复采血样的新生儿有1 040名，召回成功率27.2%。
复采血样的1 040名新生儿中，拒绝地中海贫血基因诊断者400名，最终同意做地中海贫血基因诊断的新生儿640名。其中，男性365名，占57.0%，女性275名，占43.0%，出生地区主要为禅城区和南海区，其中禅城区289名，占45.2%，南海区330名，占51.6%，三水区18名，占2.8%，高明区3名，占0.5%。如表1所示。
表1新生儿人群的基本特征(n=640)
2.新生儿地中海贫血基因确诊情况及基因型特征
α地中海贫血初筛确诊符合率88.1%(421/478)，β地中海贫血初筛确诊符合率65.7%(111/169)。初筛阳性者中进行地中海贫血基因诊断的新生儿640名，确诊阳性523名，确诊阳性率81.7%。
其中，静止型α地中海贫血201名，占38.4%，主要基因型为-α3.7/αα(63.7%)。轻型α地中海贫血197名，占37.7%，主要基因型为--SEA/αα(98.5%)。中间型α地中海贫血17名，占3.3%，主要基因型为--SEA/-α3.7(47.1%)。轻型β地中海贫血98名，占18.7%，主要基因型为CD41-42/N(49.0%)。α合并β轻型地中海贫血10名，占1.9%，主要基因型为--SEA/αα & CD41-42/N(50.0%)。初筛怀疑β轻型地中海贫血但不排除α地中海贫血者，选择做基因确诊的有158例，最后确诊为α合并β轻型地中海贫血的为4例，占2.5%(4/158)。见表2。
3.不同Hb Bart's含量确诊阳性率和确诊的α地中海贫血分型
Hb bart's含量为0.1%的共有45例，确诊阳性数24例，确诊阳性率53.3%，其中，静止型α地中海贫血占95.8%，轻型地中海贫血仅1例。Hb bart's含量为0.2%的共有72例，确诊阳性数62例，确诊阳性率86.1%，均为静止型α地中海贫血。Hb bart's含量为0.3%的共有56例，确诊阳性数50例，确诊阳性率89.3%，也均为静止型α地中海贫血。Hb bart's含量为0.4%～1%的共有73例，确诊阳性数64例，确诊阳性率87.7%，90.6%为静止型α地中海贫血，9.4%为轻型α地中海贫血。Hb bart's含量为1%～5%的共有213例，确诊阳性数202例，确诊阳性率94.8%，4.5%为静止型α地中海贫血，95.0%为轻型α地中海贫血，仅有1例为中间型α地中海贫血(Hb bart's为3.8%)。Hb bart's含量为5%～20%的共有19例，确诊阳性率100.0%，15.8%为轻型α地中海贫血，84.2%为中间型α地中海贫血。如表3所示。
表2确诊地中海贫血基因型分布情况
注：a：静止型地中海贫血部分数据缺失
讨论
地中海贫血是我国华南地区重点防治的一种单基因遗传病。不同分型的地中海贫血患者可有不同的临床表现，静止型和轻型患者可无明显的贫血症状，因此极易漏诊，中间型地中海贫血患者需终身输血，重型α地中海贫血会引起胎儿水肿综合征而无法存活，而重型β地中海贫血表现为严重溶血性贫血，多于未成年夭折。地中海贫血发病率高，是一个重大的公共卫生问题，同时也给家庭和社会带来沉重的经济负担。
表3Hb bart's带含量及确诊的α地中海贫血类型
本研究拟通过对全市地中海贫血筛查及基因诊断情况进行分析，以了解本市新生儿地中海贫血的基因型特征，以及探讨Hb Bart's 带含量尤其是临界值对α-地中海贫血分型的价值和意义，为地中海贫血健康教育以及实验室检测辅助诊断提供理论参考依据，从而指导合理婚配，预防和减少中间型及重型地中海贫血患儿的出生。本研究统计，佛山市地中海贫血初筛阳性率为13.4%，稍高于广东茂名(12.5%)和广西玉林(11.89%)[4,5]，稍低于广东梅州(13.75%)和重庆地区(13.92%)[6,7]，总体处于较高的水平。本次研究结果显示，召回成功率仅为27.2%，分析可能的原因有，首先，成功召回做基因诊断者出生地区主要为南海区和禅城区，可能是由于南海区和禅城区距离医院较近，三水区和高明区距离较远，因此召回成功率相对低。其次，召回力度可能相对不足，中心召回初筛阳性者方法是通过系统发送短信通知家长带小孩回中心做基因确诊，短信回复收到者则不再进行电话通知，短信未回复者再电话通知一次。只有中间型及重型地中海贫血患儿才会紧急召回，多次电话通知，直至患儿回中心或在其他医院确诊。此外，部分初筛阳性者选择在其他医院做地中海贫血基因确诊，而本中心并未知晓，导致召回成功率相对偏低。另外，部分采血卡片上新生儿家长电话填写有误，导致很难通知到患儿。
研究显示，α地中海贫血确诊符合率明显高于β地中海贫血，本研究的α地中海贫血确诊符合率(88.1%)稍低于南宁地区(94.16%)，而β地中海贫血确诊符合率(65.7%)高于南宁地区报道(41.10%)[8]。南宁这项研究中，β地中海贫血是以HbA<9.4%作为初筛阳性的标准，假阳性可能较高，而本次研究是根据HbA、HbA2及HbA/HbA2比值综合判定，假阳性率相对较低。本次研究中，检出主要为静止型α地中海贫血(主要基因型-α3.7/αα)和轻型α地中海贫血(主要基因型--SEA/αα)，且检出基因均为常见性，未发现罕见的基因型，该结果与广东广西等地区文献报道类似[9,10]。
在地中海贫血初筛检测中，一般来说，Hb bart's含量在0.3%及以下的基本需手动识别，尤其是临界值0.1%肉眼相对较难识别，本次研究结果中，Hb bart's含量为0.1%的确诊阳性率仅为53.3%，假阳性率相对较高，因此，临界值的初筛结果判定须谨慎，具体分型还需基因确诊。研究结果显示，Hb bart's含量低于1%，90%以上均为静止型α地中海贫血，Hb bart's含量1%～5%，95%为轻型α地中海贫血，Hb bart's含量高于5%,80%以上为中间型α地中海贫血，表明Hb bart's含量更高，提示地中海贫血分型可能更重，但是具体分型仍然须行基因诊断确诊。
参考文献
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