一例色素失禁症女婴的NEMO基因突变

朱庆文 王婧 张玲莉 卞文君 林孟思 刘江悦 陈小波 周君 顾红兵

【摘要】 目的检测一例色素失禁症(incontinentia pigmenti,IP) 新生儿及其父母核因子-κB关键调节基因(nuclear factor-κB essential modulator,NEMO) 突变。方法采集患儿及其父母外周血,提取DNA;采用多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,PCR) 检测NEMO基因是否存在频发突变共有序列NEMOΔ4-10缺失,并对NEMO基因所有外显子进行Sanger测序。结果患儿存在NEMO基因外显子4-10的杂合性缺失,父母双方均不存在NEMO基因突变,该突变为新发突变;Sanger测序表明患儿另一拷贝NEMO基因外显子及父母NEMO基因外显子均未检出有意义的突变。结论该IP患儿检出NEMO基因外显子4-10杂合性缺失,PCR扩增和Sanger测序联合检测NEMO基因突变对IP临床遗传咨询有一定的应用价值。

【关键词】色素失禁症; 核因子-κB关键调节基因; 基因突变

色素失禁症(incontinentia pigmenti,IP)是一种罕见的X连锁显性遗传皮肤病,发病率约为1/50000;男性致病基因携带者一般胎死宫内,因此患儿一般为女性,发病年龄大多在新生儿期,常伴有典型性皮肤、牙齿、骨骼、中枢神经系统以及眼部损害等临床表现,严重的可导致角膜病变、视网膜剥离、癫痫和智力障碍等[1]。IP典型的皮肤损害表型包括四个阶段[2]:早期红斑基础上出现水泡、色素过度沉着和形成皮肤瘢痕。依照2013 年修正后的诊断标准,新生儿期IP临床诊断主要依据典型性皮疹等临床特征和IP疾病家族史。IP致病基因分别被定位在Xp11和Xq28[3,4],其中80%~90%的IP患者均存在Xq28上的核因子-κB关键调节基因(nuclear factor-κB essential modulator,NEMO)基因外显子4-10缺失,NEMO基因重排还包括少量的点突变、微重复和缺失等[5]。本文对1例疑似IP 患儿及其父母进行NEMO基因突变检测和分析,从遗传学角度确诊该例IP患儿及其致病基因遗传机制。

对象与方法

1.对象

研究对象:该例女婴于2015年7月16日在他院出生,外观无异常,出生后3h,发现皮肤出现红色皮疹,并逐渐增多,少许破溃。体格检查四肢可见较多红色斑疹,部分突出皮肤,双下肢大腿内侧近腹股沟处可见多枚小水泡,部分水泡破溃见澄清分泌物(图1),眼部暂时无异常发生,符合IP诊断标准。因为患者的四肢及躯干因在出生后或出生后不久进行性出现红斑,水疱和线性色素沉着,初步诊断为IP。

家系调查:父母非近亲结婚,家族无色素失禁症疾病史。

2.方法

(1)提取外周血DNA:本研究经我院伦理委员会批准,患者家属签署知情同意书后,采集患儿及其父母外周血标本,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,并采集3名无亲缘关系的表型正常个体外周血作为对照。

采用北京天根生化科技公司微量样品基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,操作方法按说明书要求进行,UV-1800PC型紫外分光光度计(山东博科生物产业有限公司)检测DNA样本,A260/A280和A260/A230比值分别控制在1.8~2.0和2.0~2.5之间。

(2)NEMO基因重排检测:采用Steffann法(图2a),即长链多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,PCR)扩增方法(引物Int3s/L2Rev)检测NEMO基因/△NEMO假基因是否缺失共有序列NEMO△4-10,上游引物分别为Int3s和Rep3s,Int3s位于内含子3,Rep3s分别和Int3s下游311-bp片段及外显子10下游4033-bp片段匹配,下游引物L2Rev位于NEMO基因端粒末端。根据PCR扩增产物的凝胶电泳条带大小分析NEMO基因/△NEMO基因重排情况,PCR扩增出现1045-bp条带表明DNA样本存在共有序列NEMO△4-10缺失。

若DNA样本存在共有序列NEMO△4-10缺失则增加验证实验鉴定NEMO基因是否缺失共有序列NEMO△4-10(图2,引物In2S/L2Rev),PCR引物设计原理如图2;上游引物 In2S只能匹配NEMO真基因内含子序列,下游引物L2Rev同时匹配NEMO真基因和△NEMO假基因。PCR扩增出现2243-bp条带表明NEMOZ真基因存在共有序列NEMO△4-10缺失。

设计引物(表1)分别扩增各样本NEMO基因外显子1、外显子2和外显子3-10片段,PCR产物进行Sanger测序,相关PCR引物序列见表1。所用测序仪为ABI 3500,利用Sequence Analysis软件处理ABI3500产生的数据文件,然后利用Mutation Surveyor 4.0软件分析基因的突变情况,测序结果与NCBI公布的NEMO基因所有外显子序列进行比对,寻找外显子突变位点。

经优化,建立如下PCR反应体系。

NEMO基因/△NEMO假基因共有序列NEMO△4-10缺失和验证的PCR反应体系(25 μl):5×GC Buffer 5 μl, dNTP 2 μl,上下游引物各 1 μl,PrimSTAR 0.5 μl,DNA模板2 μl(20 ng)ddH2O 13.5 μl。反应条件为:98 ℃预变性30 s,30个循环(98 ℃10 s,67 ℃ 20 s,68 ℃ 2 min),68 ℃延伸10 min,4 ℃保存10 s。

扩增NEMO基因外显子的PCR反应体系(50 μl):5×Buffer 10 μl,dNTP 4 μl, 上下游引物各2 μl, PrimSTAR 1 μl,DNA模板 2 μl(20ng),dd H2O 29 μl,反应条件为:98 ℃预变性30 s,30个循环(98 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,68 ℃ 4 min),68 ℃延伸10 min,4 ℃保存10 s。

表1相关引物序列表

PrimerinformationName SequenceLengthInt3sCCACTCAGGGCTTAGAGCGC20Rep3sCTCTTTTGACAAGAACACCGGA22L2RevTCGGAGACACAGGAACCAGCA21In2SCAGTGCCTGGCCAACACGTAC21NEMO⁃LPCR⁃e1FCCTCCCACAGGCCCATCAT19NEMO⁃LPCR⁃e1RCCTTCTCAGGACTCCCACCC20NEMO⁃LPCR⁃e2FGGTCCAGCACCTCCCTTTG19NEMO⁃LPCR⁃e2FCCCTGTCCCTCCTTTCCCT19NEMO⁃LPCR⁃e3⁃e10FTGCTGCCCTCCCTCTTGGTTTCAGG25NEMO⁃LPCR⁃e3⁃e10RCGCCCATGCTCAGTGGTGTCACTTCTC27

结果

经过家系调查,该患儿父母非近亲结婚,家族内成员无IP患病史,故该例IP患儿是散发病例。

Steffann方法中,患儿基因组DNA用引物Int3s/L2Rev PCR扩增出1045-bp条带(图3A),表明NEMO基因/△NEMO基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失,而患儿父母及正常人样本均未扩增出1045-bp条带;患儿基因组DNA用NEMO基因上游特异性引物In2S和下游引物L2Rev PCR扩增出2243-bp的特异性条带(图3B),确定NEMO基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失,患儿父母及正常人样本均未扩增出2243-bp的特异性条带。

患儿基因组DNA经引物NEMO-LPCR-e3-e10F/ NEMO-LPCR-e3-e10R PCR扩增出12818-bp条带(图3D),表明该IP患儿NEMO基因外显子4-10是单拷贝缺失;经外显子Sanger测序,该患儿另一拷贝NEMO基因外显子未发现任何点突变、微缺失或者微重复,患儿父母也未发现NEMO基因外显子的任何突变,外显子Sanger测序结果进一步证实了该IP患儿的NEMO基因外显子4-10杂合性缺失是散发突变,并不是遗传自父母。

讨论

IP又称Bloch-Sulzberger综合征,是一种累及多系统,以皮肤损害为主,伴有眼、牙齿、骨骼及中枢神经系统异常的、罕见的X染色体连锁显性遗传病。Smahi在2000年第一次验证了NEMO基因突变导致NF-κB的功能受损,影响免疫调节、炎症反应、细胞凋亡和细胞增殖等,最终导致IP发病;该研究还指出80 %~90 %的IP患者均存在Xq28上的NEMO基因外显子4-10缺失。NEMO基因大小为23-kb,由10个外显子组成,第一个外显子包含3个非编码可变外显子[6]

NEMO基因序列在X染色体上有两个拷贝,分别为NEMO基因和ΔNEMO假基因。ΔNEMO假基因只包含外显子3-10,重复序列始于外显子3上游282-bp,止于外显子10下游9.9-kb,外显子排列的顺序与真基因相反。真假基因均具有共有序列NEMO△4-10,共有序列缺失片段位于3号外显子3′端到10号外显子区域的一段MER67B 重复序列处,大约有1045-bp[7],该缺失片段既可发生在NEMO基因内也可发生在ΔNEMO假基因内。

该例患儿没有IP家族史,为了确诊其遗传学原因,根据Steffann方法[8]设计引物:引物Rep3s/L2Rev扩增出733-bp条带,作为内参,以检测PCR体系和条件是否最优化;引物Int3s/L2Rev PCR扩增出1045-bp的条带,表明NEMO基因/△NEMO假基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失;该方案不能判断NEMO真基因是否发生共有序列NEMOΔ4-10 缺失。因而,本研究后续采用上游引物In2S和下游引物L2Rev,引物In2S特异性结合NEMO真基因,扩增出2243-bp条带即表明NEMO真基因存在共有序列缺失。为了检查患儿及家属是否存在NEMO基因其他基因重排方式,本研究还对患儿及父母NEMO基因所有外显子进行Sanger测序;测序结果显示,父母双方NEMO基因所有外显子均未检出任何突变,患儿另外一个拷贝NEMO基因所有外显子也未检出任何突变,表明了该例患儿NEMO基因外显子4-10杂合性缺失,是散发突变,而非遗传自父母。此外,对临床表型轻微或无IP表型的患者,或者未检出共有序列NEMO△4-10缺失的患者,可以考虑通过测序等方法进一步检测患者是否存在NEMO基因的微小突变。

研究[9]表明了NEMO基因共有序列NEMO△4-10片段缺失是IP患者基因突变的主要方式。本研究虽然只有1例IP患儿,但是经过NEMO基因突变筛查和测序验证,证实了该例IP患儿存在NEMO基因外显子4-10杂合性缺失,为新生儿IP筛查和确诊提供一定的参考价值。

(图1)

参考文献

1 Chen AY,Chen K.Dental treatment considerations for a pediatric patient with incontinentia pigmenti (Bloch-Sulzberger syndrome).Eur J Dent,2017,11:264-267.

2 Dangouloff-Ros V,Hadj-Rabia S,Oliveira Santos J,et al.Severe neuroimaging anomalies are usually associated with random X inactivation in leucocytes circulating DNA in X-linked dominant Incontinentia Pigmenti.Mol Genet Metab,2017 Jul 10.pii:S1096-7192(17)30288-3.[Epub ahead of print].

3 Van Asbeck E,Ramalingam A,Dvorak C,et al.Duplication at Xq28 involving IKBKG is associated with progressive macrocephaly,recurrent infections,ectodermal dysplasia,benign tumors,and neuropathy.Clin Dysmorphol,2014,23:77-82.

4 Fusco F,Paciolla M,Napolitano F,et al.Genomic architecture at the Incontinentia Pigmenti locus favours de novo pathological alleles through different mechanisms.Hum Mol Genet,2012,21:1260-1271.

5 Ohnishi H,Kishimoto Y,Taguchi T,et al.Immunodeficiency in Two Female Patients with Incontinentia Pigmenti with Heterozygous NEMO Mutation Diagnosed by LPS Unresponsiveness.J Clin Immunol,2017 Jul 12.[Epub ahead of print].

6 Narayanan MJ,Rangasamy S,Narayanan V.Incontinentia pigmenti (Bloch-Sulzberger syndrome).Handb Clin Neurol,2015,132:271-280.

7 Fusco F,Paciolla M,Pescatore A.Microdeletion/duplication at the Xq28 IP locus causes a de novo IKBKG/NEMO/IKKgamma exon4_10 deletion in families with Incontinentia Pigmenti.Hum Mutat,2009,30:1284-1291.

8 Bal E,Laplantine E,Hamel Y,et al.Lack of interaction between NEMO and SHARPIN impairs linear ubiquitination and NF-κB activation and leads to incontinentia pigmenti.J Allergy Clin Immunol,2017 Feb 27.pii:S0091-6749(17)30321-4.

9 Araki Y,Abe Y,Takeda Y,et al.Incontinentia pigmenti with retinal vascular anomaly and deletion of exons 4-10 in NEMO.J Dermatol,2017,44:976-977.

作者单位:226000 江苏南通,南通市妇幼保健院

通讯作者:顾红兵(18906292120@189.cn)

(收稿日期:2017-04-14)