色素失禁症(incontinentia pigmenti,IP)是一种罕见的X连锁显性遗传皮肤病，发病率约为1/50000；男性致病基因携带者一般胎死宫内，因此患儿一般为女性，发病年龄大多在新生儿期，常伴有典型性皮肤、牙齿、骨骼、中枢神经系统以及眼部损害等临床表现，严重的可导致角膜病变、视网膜剥离、癫痫和智力障碍等[1]。IP典型的皮肤损害表型包括四个阶段[2]：早期红斑基础上出现水泡、色素过度沉着和形成皮肤瘢痕。依照2013 年修正后的诊断标准，新生儿期IP临床诊断主要依据典型性皮疹等临床特征和IP疾病家族史。IP致病基因分别被定位在Xp11和Xq28[3,4]，其中80%～90%的IP患者均存在Xq28上的核因子-κB关键调节基因(nuclear factor-κB essential modulator,NEMO)基因外显子4-10缺失，NEMO基因重排还包括少量的点突变、微重复和缺失等[5]。本文对1例疑似IP 患儿及其父母进行NEMO基因突变检测和分析，从遗传学角度确诊该例IP患儿及其致病基因遗传机制。
对象与方法
1.对象
研究对象：该例女婴于2015年7月16日在他院出生，外观无异常，出生后3h，发现皮肤出现红色皮疹，并逐渐增多，少许破溃。体格检查四肢可见较多红色斑疹，部分突出皮肤，双下肢大腿内侧近腹股沟处可见多枚小水泡，部分水泡破溃见澄清分泌物(图1)，眼部暂时无异常发生，符合IP诊断标准。因为患者的四肢及躯干因在出生后或出生后不久进行性出现红斑，水疱和线性色素沉着，初步诊断为IP。
家系调查：父母非近亲结婚，家族无色素失禁症疾病史。
2.方法
(1)提取外周血DNA：本研究经我院伦理委员会批准，患者家属签署知情同意书后，采集患儿及其父母外周血标本，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝，并采集3名无亲缘关系的表型正常个体外周血作为对照。
采用北京天根生化科技公司微量样品基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作方法按说明书要求进行，UV-1800PC型紫外分光光度计(山东博科生物产业有限公司)检测DNA样本，A260/A280和A260/A230比值分别控制在1.8～2.0和2.0～2.5之间。
(2)NEMO基因重排检测：采用Steffann法(图2a)，即长链多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction，PCR)扩增方法(引物Int3s/L2Rev)检测NEMO基因/△NEMO假基因是否缺失共有序列NEMO△4-10，上游引物分别为Int3s和Rep3s，Int3s位于内含子3，Rep3s分别和Int3s下游311-bp片段及外显子10下游4033-bp片段匹配，下游引物L2Rev位于NEMO基因端粒末端。根据PCR扩增产物的凝胶电泳条带大小分析NEMO基因/△NEMO基因重排情况，PCR扩增出现1045-bp条带表明DNA样本存在共有序列NEMO△4-10缺失。
若DNA样本存在共有序列NEMO△4-10缺失则增加验证实验鉴定NEMO基因是否缺失共有序列NEMO△4-10(图2，引物In2S/L2Rev)，PCR引物设计原理如图2；上游引物 In2S只能匹配NEMO真基因内含子序列，下游引物L2Rev同时匹配NEMO真基因和△NEMO假基因。PCR扩增出现2243-bp条带表明NEMOZ真基因存在共有序列NEMO△4-10缺失。
设计引物(表1)分别扩增各样本NEMO基因外显子1、外显子2和外显子3-10片段，PCR产物进行Sanger测序，相关PCR引物序列见表1。所用测序仪为ABI 3500，利用Sequence Analysis软件处理ABI3500产生的数据文件，然后利用Mutation Surveyor 4.0软件分析基因的突变情况，测序结果与NCBI公布的NEMO基因所有外显子序列进行比对，寻找外显子突变位点。
经优化，建立如下PCR反应体系。
NEMO基因/△NEMO假基因共有序列NEMO△4-10缺失和验证的PCR反应体系(25 μl)：5×GC Buffer 5 μl， dNTP 2 μl，上下游引物各 1 μl，PrimSTAR 0.5 μl，DNA模板2 μl(20 ng)ddH2O 13.5 μl。反应条件为：98 ℃预变性30 s，30个循环(98 ℃10 s，67 ℃ 20 s，68 ℃ 2 min)，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 s。
扩增NEMO基因外显子的PCR反应体系(50 μl)：5×Buffer 10 μl，dNTP 4 μl， 上下游引物各2 μl， PrimSTAR 1 μl，DNA模板 2 μl(20ng)，dd H2O 29 μl，反应条件为：98 ℃预变性30 s，30个循环(98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 4 min)，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 s。
表1相关引物序列表
结果
经过家系调查，该患儿父母非近亲结婚，家族内成员无IP患病史，故该例IP患儿是散发病例。
Steffann方法中，患儿基因组DNA用引物Int3s/L2Rev PCR扩增出1045-bp条带(图3A)，表明NEMO基因/△NEMO基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失，而患儿父母及正常人样本均未扩增出1045-bp条带；患儿基因组DNA用NEMO基因上游特异性引物In2S和下游引物L2Rev PCR扩增出2243-bp的特异性条带(图3B)，确定NEMO基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失，患儿父母及正常人样本均未扩增出2243-bp的特异性条带。
患儿基因组DNA经引物NEMO-LPCR-e3-e10F/ NEMO-LPCR-e3-e10R PCR扩增出12818-bp条带(图3D)，表明该IP患儿NEMO基因外显子4-10是单拷贝缺失；经外显子Sanger测序，该患儿另一拷贝NEMO基因外显子未发现任何点突变、微缺失或者微重复，患儿父母也未发现NEMO基因外显子的任何突变，外显子Sanger测序结果进一步证实了该IP患儿的NEMO基因外显子4-10杂合性缺失是散发突变，并不是遗传自父母。
讨论
IP又称Bloch-Sulzberger综合征，是一种累及多系统，以皮肤损害为主，伴有眼、牙齿、骨骼及中枢神经系统异常的、罕见的X染色体连锁显性遗传病。Smahi在2000年第一次验证了NEMO基因突变导致NF-κB的功能受损，影响免疫调节、炎症反应、细胞凋亡和细胞增殖等，最终导致IP发病；该研究还指出80 %～90 %的IP患者均存在Xq28上的NEMO基因外显子4-10缺失。NEMO基因大小为23-kb，由10个外显子组成，第一个外显子包含3个非编码可变外显子[6]。
NEMO基因序列在X染色体上有两个拷贝，分别为NEMO基因和ΔNEMO假基因。ΔNEMO假基因只包含外显子3-10，重复序列始于外显子3上游282-bp，止于外显子10下游9.9-kb，外显子排列的顺序与真基因相反。真假基因均具有共有序列NEMO△4-10，共有序列缺失片段位于3号外显子3′端到10号外显子区域的一段MER67B 重复序列处，大约有1045-bp[7]，该缺失片段既可发生在NEMO基因内也可发生在ΔNEMO假基因内。
该例患儿没有IP家族史，为了确诊其遗传学原因，根据Steffann方法[8]设计引物：引物Rep3s/L2Rev扩增出733-bp条带，作为内参，以检测PCR体系和条件是否最优化；引物Int3s/L2Rev PCR扩增出1045-bp的条带，表明NEMO基因/△NEMO假基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失；该方案不能判断NEMO真基因是否发生共有序列NEMOΔ4-10 缺失。因而，本研究后续采用上游引物In2S和下游引物L2Rev，引物In2S特异性结合NEMO真基因，扩增出2243-bp条带即表明NEMO真基因存在共有序列缺失。为了检查患儿及家属是否存在NEMO基因其他基因重排方式，本研究还对患儿及父母NEMO基因所有外显子进行Sanger测序；测序结果显示，父母双方NEMO基因所有外显子均未检出任何突变，患儿另外一个拷贝NEMO基因所有外显子也未检出任何突变，表明了该例患儿NEMO基因外显子4-10杂合性缺失，是散发突变，而非遗传自父母。此外，对临床表型轻微或无IP表型的患者，或者未检出共有序列NEMO△4-10缺失的患者，可以考虑通过测序等方法进一步检测患者是否存在NEMO基因的微小突变。
研究[9]表明了NEMO基因共有序列NEMO△4-10片段缺失是IP患者基因突变的主要方式。本研究虽然只有1例IP患儿，但是经过NEMO基因突变筛查和测序验证，证实了该例IP患儿存在NEMO基因外显子4-10杂合性缺失，为新生儿IP筛查和确诊提供一定的参考价值。
(图1)
参考文献
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3 Van Asbeck E,Ramalingam A,Dvorak C,et al.Duplication at Xq28 involving IKBKG is associated with progressive macrocephaly,recurrent infections,ectodermal dysplasia,benign tumors,and neuropathy.Clin Dysmorphol,2014,23:77-82.
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