卵巢癌在妇科肿瘤中发病率居第三位，而其致死率却占据首位[1]。卵巢癌早期治疗，其5年生存率可达92%，然而进展期卵巢癌5年生存率不足30%[2]。因此卵巢癌的早期诊断与早期治疗可有效改善预后[3]。糖类抗原125(cancer antigen 125，CA125)是临床第一个用于检测卵巢癌的血清标志物，于1981年首次被Bast等发现[4]。此后的临床应用中发现其在卵巢癌的诊断中特异性不高[5]。人附睾分泌蛋白4(human epididymis secretory protein 4,HE4)作为一个新的卵巢癌的肿瘤标志物[6]，得到了人们更加深入的研究[7,8]。
目前常用的HE4检测的方法有化学发光免疫分析法(CLIA)[9]，本项目采用以磁珠作为载体，吖啶酯标记检测抗体的化学发光免疫分析技术开发HE4定量检测试剂盒，其操作简单，试剂较稳定，用于辅助疾病预防与控制、临床用药等。
对象与方法
1.研究对象
选择2014年9月—2015年10月在内蒙古医科大学附属医院，内蒙古医科大学附属人民医院收治的经手术病理检查报告确诊为卵巢恶性肿瘤组和盆腔良性肿瘤组患者，根据国际妇产科联盟(FIGO)2009手术病理分期标准，56例上皮性卵巢癌患者，盆腔肿瘤组89例，妇科其他良性肿瘤88例，外科肿瘤48例，同期妇科体检对照组84例。共入组了365例女性血清样本，年龄分布在16～92岁，其中34岁及以下有52例(14%)、35～44岁有70例(19%)、45～54岁有106例(29%)、55～64岁有72例(20%)、65岁及以上有65例(18%)。获得住院患者所在医院的医学伦理委员会的批准，经签署知情同意书后采集标本。
2.试剂和仪器
试验组采用广州市达瑞生物技术股份有限公司研制开发的“HE4定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)” (注册号：国食药监械(进)字2012第3400236号)，根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，本次临床研究采用盲法、对比的试验设计，选择已上市同类试剂德国罗氏HE4检测试剂盒(电化学发光法)(注册号：国食药监械(进)字2012第3400236号)，作为复核试剂检测，同时使用德国罗氏试剂盒检测CA125水平。
3.检测方法
血清检测采用德国罗氏E601全自动电化学免疫分析仪，所有操作均严格按照试剂盒及仪器说明书进行。阳性结果评价血清HE4及CA125的参考值分别0～140 pmol/L与0～35 U/mL。
4.统计学方法
采用Excel对所有病例资料及血清检测数据建立数据库，采用SPSS 13.0软件进行数据处理。计量资料，实验数据符合正态分布以均数±标准差
±s)表示，数据呈偏态分布，用中位数，第1和第3四分位数Q1-Q3描述，各组与卵巢肿瘤组之间的差异用Wilcoxon秩和检验进行。组间比较用非参数Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料以百分比表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法，Pearson 回归分析两种不同方法检测HE4的数量相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.两种试剂盒分别检测上皮性卵巢癌,盆腔良性肿物与其他妇科良性肿瘤，外科肿瘤及健康组血清HE4的浓度
国产达瑞试剂盒检测卵巢癌组的血清HE4浓度中位数是189.8 pmol/L 高于盆腔肿物组(72.7 pmol/L)、妇科其他良性疾病组(47.7 pmol/L)、外科肿瘤组(69.4 pmol/L)及妇科体检对照组(42.4 pmol/L)，差异有统计学意义；德国罗氏检测试剂盒检测的上皮性卵巢癌组，盆腔肿物组，妇科良性肿瘤组，外科肿瘤组，体检对照组的HE4浓度中位数分别是209.3 pmol/L，77.2 pmol/L，51.5 pmol/L，74.2 pmol/L，45.2 pmol/L，差异有统计学意义(见表1)。
表1两种检测试剂盒检测HE4在不同人群中的浓度中位数比较
注：M为中位数浓度，Q1、Q3为第1和第3四分位数(pmol/L),*各组分别与上皮性卵巢癌组相比，均P<0.01
2.使用HE4-达瑞,HE4-罗氏，CA125试剂盒检测I，II期，III、IV期卵巢癌HE4的浓度
达瑞试剂盒检测卵巢癌III、IV 期HE4浓度中位数为(236.3 pmol/L)显著高于I、II期HE4浓度(96.4 pmol/L)，差异有统计学意义；德国罗氏检测卵巢癌III、IV 期HE4浓度(227.4 pmol/L)显著高于I、II期(101.2 pmol/L)(P<0.01)；CA125 I、II期和III、IV 期浓度分别为67.8 U/mL和206.4 U/mL，差异具有统计学意义(见表2)。
表2使用HE4 -达瑞,HE4-罗氏，CA125试剂盒检测不同期卵巢癌M(Q1-Q3)
*表示HE4-达瑞(pmol/L),§HE4-罗氏(pmol/L)，
CA125(U/mL)检测卵巢I，II期浓度中位数与卵巢癌III、IV期相比分别为P<0.01
3.HE4-达瑞，HE4-罗氏单独与联合检测早期和晚期卵巢癌的敏感度比较
在早期卵巢癌I，II期，单独使用HE4-达瑞检测卵巢癌敏感度为80.6%，联合CA125检测为83.3%，HE4-罗氏单独检测为58.3%，联合CA125为66.7%，HE4-达瑞在早期单独或联合检测诊断卵巢癌其敏感度均优于HE4-罗氏(P<0.05)。在晚期卵巢癌III、IV期，单独使用HE4-达瑞检测卵巢癌敏感度为85.0%，联合CA125检测为90.0%，HE4-罗氏单独检测为80.0%，联合CA125为85.0%，HE4-达瑞与HE4-罗氏在晚期卵巢癌检测中的敏感度差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。
表356例上皮性卵巢癌HE4-达瑞，HE4-罗氏单独与联合检测早期晚期的敏感度
注：+代表HE4大于170 pmol/L，或CA-125大于35(U/mL)；-代表HE4在0-170 pmol/L，或CA-125在0-35(U/mL);*表示HE4 -达瑞单独检测卵巢癌I，II期敏感性与HE4-罗氏检测卵巢癌I，II期相比P均<0.05；§表示HE4-达瑞联合CA125检测卵巢癌I，II敏感度与HE4-罗氏联合检测卵巢癌I，II期相比P均<0.05
4.线性范围内测值的相关性分析
全部数据的散点图显示HE4达瑞与HE4罗氏间线性关系高度一致。对应超出待考核试剂线性范围的6例样本，进行稀释后重检,线性回归方程为Y=5.017+1.006X，线性回归的决定系数r值高达0.973(P<0.001)。(见图1)。
图1 线性范围内测值的相关性分析散点图
讨论
目前常用的HE4检测的方法有酶联免疫吸附测定(ELISA)[10]、时间分辨荧光免疫分析法(TRIFA)[11]、化学发光免疫分析法(CLIA)[9,12]。传统的ELISA检测方法灵敏度低，适用于定性和半定量检测；时间分辨操作复杂，反应时间长，试剂成本高。化学发光操作简单，试剂较稳定[13]，进口试剂成本较高，国产试剂合理。
本次临床研究采用盲法、对比的试验设计，对广州市达瑞生物技术股份有限公司生产的“人附睾分泌蛋白4(HE4)定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)”进行了临床试验研究。整个临床试验过程均在严格控制下进行，由经专门培训的测试人员进行检测分析。
本次临床研究共入组了365例。入组的样本中包含的疾病主要有：卵巢癌、盆腔肿物、妇科良性疾病、外科肿瘤。有359例样本的待考核测值与对照测值均在对应试剂盒的线性范围内，有6例超出了待考核试剂的线性范围，超出待考核试剂线性范围的6例样本，进行稀释后重检。对于线性范围内的359例样本测值进行相关性分析得：待考核测值与对照测值得相关系数r值为0.973。由此可见，本次临床试验结果表明待考核试剂盒测定结果较为准确、稳定和可靠，与现行试剂检测性能相同。
HE4首先在附睾远端的上皮中被发现，属于乳清酸性4-二硫化中心蛋白家族,具有疑似胰蛋白酶抑制剂的特性[14]。分泌型HE4已经在卵巢癌患者的血清中检测到有高水平表达[15]。使用达瑞试剂盒和德国罗氏检测试剂盒检测卵巢癌组的血清HE4浓度高于盆腔肿物组、妇科良性疾病组、外科肿瘤组及体检对照组。两种试剂盒都可以较准确地检测到血清HE4浓度，两种检验方法无显著性的差别。
近年来，CA125不同维度地运用，使其增加了在卵巢癌筛查、诊断、评估及预后判断方面的价值[16]。进一步分析卵巢癌不同病理分期组的HE4与CA125的表达量，卵巢癌III、IV 期HE4浓度中位数明显高于I、II期。卵巢癌组患者血 HE4水平均高于对照组和其他疾病组 且Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者、血清肿瘤标志物水平分别高于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明血清HE4检测在卵巢癌的诊断中具有重要价值[17]。达瑞化学发光试剂盒HE4联合CA125诊断早期卵巢癌敏感度为83.3%，罗氏化学发光试剂盒HE4 联合CA125诊断早期卵巢癌敏感度为66.7%，达瑞、罗氏HE4 试剂盒联合CA125检测在晚期卵巢癌的诊断中的敏感度分别为 90.0%和80.0%。达瑞采用以磁珠作为载体，吖啶酯标记检测抗体的化学发光免疫分析技术开发HE4定量检测试剂盒，在诊断早期卵巢癌方面较好。HE4联合CA125测定有助于卵巢癌的诊断，可作为很好的卵巢癌标志物，提高早期卵巢癌的诊断率[18]。
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