HPV E6/E7mRNA在宫颈癌中的应用进展

宫颈癌是最常见的危害女性健康的妇科恶性肿瘤之一，WHO发布的全球癌症报告显示，2012年世界宫颈癌新发病例约52.7万例，死亡病例约26.5万例，约85%的病例集中在发展中国家[1]。大量病因学及流行病学研究表明，高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是导致宫颈癌发生发展的主要病因，约99.7%的宫颈癌组织中可以检测到HR-HPV的存在[2]，但是HPV确切的致病机制尚未完全阐明。随着分子诊断在肿瘤早期筛查及个性化诊断等领域的快速发展，Nakagawa发现的HPV E6/E7mRNA分子备受关注。研究表明HPV mRNA在病毒与宿主基因持续整合时表达上调，并与宫颈病变和癌变关系密切，在宫颈癌筛查和分流中已显现出重要作用。理论上该分子也有可能用于疫苗的研发，值得我们更多关注和研究。本文就HPV E6/E7mRNA致病的理论基础、检测试剂、临床应用、疫苗方面予以综述。

一、HPV E6/E7mRNA致病的理论基础

迄今全基因组测序发现的HPV基因型超过200种[3]，已确定与宫颈癌密切相关的HR-HPV有15种(16，18，31，45，33，35，39，51，52，56，58，59，68，82，73)。人乳头瘤病毒的致病机制与其结构密切相关。HPV属乳头瘤空泡病毒，是一种球形无包膜病毒体，其二十面体核衣壳中包含了由7800～7900个碱基对组成的双链环状DNA，包括早期区(early region，E区)，晚期区(late region，L区)，长调控区(long control region，LCR区)。E区含E6、E7、E1、E2、E4、E5，六个开放读码框(open reading frame，ORFs)，分别编码E6、E7、E1、E2、E4、E5癌蛋白，早期ORFs影响病毒的感染、复制、转录及翻译；L区含L1和L2两个开放读码框，分别编码L1、L2结构蛋白，即大、小衣壳蛋白，影响着病毒在细胞表面的吸附、吞噬、入胞及病毒颗粒的包装等过程；LCR区也叫非基因编码区，位于L1和E6之间，可增强基因转录、影响病毒的致病力，以及调控蛋白的生成[4]。其中E6和E7 被认为是HPV最主要的致病基因。在HPV持续感染机体时，病毒与宿主基因在细胞核内发生整合，相应的启动子及转录因子被激活，并以整合后的DNA的一条链为模板转录生成RNA，其中转录产物RNA中以携带早期ORFs的多顺反子mRNA最为重要，以它为翻译的直接模板，辅以tRNA 、rRNA等分子，最终在细胞质内合成E6和E7癌蛋白[5]。E7癌蛋白主要通过结合并降解pRb蛋白(抑癌基因产物)，促进细胞无限增殖，E6癌蛋白则通过与P53蛋白结合并促使其降解，阻断细胞凋亡[6]。在整个基因表达过程中，E6和E7及其上游基因被保留，而大多数E区及壳蛋白编码基因被破坏。其中E2基因的破坏很关键(E2发挥抑制转录的作用)，E2蛋白的失活会引起E6 和E7基因过度表达，使得转录和翻译持续不断地进行，癌蛋白大量积累，抑癌基因产物P53和pRb蛋白失活，细胞周期调节失控而发生“永生化”，进一步诱发细胞染色体数目和结构的改变，使病变不可逆[7,8]。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA分子作为转录产物，即代表着基因整合程度，亦控制着癌蛋白的表达，是癌基因发挥作用的重要一环，其表达水平的高低与病毒宿主基因整合及感染状态相关联。大量研究表明，在HR-HPV发生一过性或早期感染时，病毒DNA在细胞核内处于游离状态，E6/E7mRNA不表达或低表达；当HR-HPV持续感染时，病毒DNA与宿主基因整合，E6/E7被激活，E6/E7mRNA高水平表达。因此HPV E6/E7 mRNA是病毒基因活跃状态的关键性标志物，在HPV的致病过程中起着关键的枢纽作用。

二、HPV E6/E7mRNA 检测试剂

全球有4种HPV检测试剂获FDA批准上市，分别为基于杂交捕获技术的Hyrid Capture2，基于酶切信号放大技术的Cervista HPV，基于实时荧光PCR技术的Cobas HPV，以及基于转录介导等温扩增技术的AptimaTM HPV。前三种属于第一代检测法，都以检测HPV DNA为主，但不能反映感染细胞内基因的整合程度及病毒载量。Aptima属于第二代检测法，以检测HPV mRNA片段为主，可从基因整合及转录层面上检测病毒活跃状态，弥补了第一代检测的缺陷[9]。HPV mRNA 二代检测法上市仅6年，在美国和欧洲的应用率已不亚于细胞学和HPV DNA检测法。我国2015年首次引进HPV mRNA检测技术Aptima，目前其应用主要集中在大中型城市和地区医院，基层医院由于技术人员、设备、费用等限制，更多的还是依靠细胞学和HPV DNA检测，且总体上我国女性对HPV mRNA检测用于宫颈癌筛查和分流的认知水平低于液基细胞学和HPV DNA，相关知识的普及教育是迫切的。

临床中报道有关HPV E6/E7mRNA分子的商品化试剂已有十余种，如Aptima HPV Assay，PreTect HPV-Proofer、Quantivirus及OncoTect 和Nuclisens等，每种试剂的方法都有不同。其中Aptima HPV 采用转录介导扩增法及杂交保护试验对mRNA进行检测，可检出14种HR-HPV E6/E7 mRNA(16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)，大量的研究显示其对检测≥CIN2病变的特异性和敏感度高达90%以上。PreTect HPV Proofer是基于核酸序列扩增技术的一种实时多重测定法，使用分子信号探针进行检测，可检出HPV16、18、31、35、45型，Alaghehbandan等临床研究显示其在检测≥CIN2病变的特异性及敏感度分别为71.6%和74.2%[10]。Quantivirus HPV Assay是基于分支DNA的核酸杂交技术，可检测14种HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)，沈勇等研究报道其在检测≥CIN2病变时的特异性为74.1%、敏感度为58.5%[11]。通过以上及检索查阅大量相关文献发现，HPV mRNA二代检测中除了Aptima检测试剂，没有一个同时显示出高灵敏度和高特异性。正如FASE研究表明Aptima HPV既保留了HPV DNA的敏感性，又具有接近细胞学检测的特异性，实现了敏感性和特异性的良好平衡，且安全性好、操作简单，因此而成为所有商品试剂中应用最广的一种[12]。而其它相关试剂盒虽也经济实惠、操作简单，但是对疾病检测的准确性并没有如商家所声称的那样高，易造成误诊和漏诊，这些试剂如能进一步改善技术和方法提高准确性，则未来在临床中可能会得到更广的应用。

三、HPV E6/E7mRNA的临床应用

宫颈癌筛查有两大技术：细胞学检查和HPV检测，HPV检测又分HPV DNA 和HPV mRNA。2016年1月，美国妇产科医师学会发布了最新宫颈癌的筛查和预防实践指南，新指南推荐30～65岁女性行细胞学+HPV DNA联合筛查，并指出HPV DNA可用于≥25岁女性的初筛，这突显了HPV DNA筛查的重要地位[13]。HPV DNA的重要性源于其高敏感度和良好的阴性预测值，USPSTF研究指出HPV DNA检测对≥CIN2病变的检测敏感度比细胞学高，敏感度平均增加了35.7%。但HPV DNA也存在缺陷，因为90%以上的HPV感染都是一过性的，平均在8～24个月内被机体清除[14]，检测时会不可避免的会包含一过性HPV阳性结果，同时病毒和宿主基因整合易发生L1区的缺失，最终使以L1区为目标的HPV DNA检测假阳性率高、特异度低。研究显示HPV DNA的特异度比细胞学平均损失了7%，而HPV mRNA检测正好可以弥补HPV DNA检测的这一缺陷[15]。Monsonego等评估了HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA和液基细胞学检测在宫颈癌初筛中的应用，HPV DNA、HPV E6/E7mRNA、细胞学在检测≥CIN2以上病变时的敏感度分别为96.3%、96.3%、74.1%，特异性分别为85.9%、91.0%、91.4%，FASE研究表明HPV E6/E7mRNA在检测≥CIN2以上病变时的临床敏感性、阴性预测值及筛查间隔与HPV-DNA相似，且特异性更高，对数据进行统计学校正后得出HPV mRNA 比HPV DNA特异性平均提高了5%左右[16]。Haedicke等人发表的临床荟萃分析与Monsonego的研究结果一致，并指出HPV E6/E7mRNA较HPV DNA和细胞学能更有效的筛出真正的高危人群(宫颈病变≥CIN2级)，降低过度治疗，可在初筛中单独应用[17]。也有学者建议，实施HPV mRNA 和HPV DNA 联合筛查，但是考虑费用等原因，目前暂不推荐。

筛查出HPV DNA阳性患者如何进行分流很重要。如果对所有HPV DNA阳性患者进行阴道镜检查，不但会造成过度诊疗，也给患者增加了不必要的心理压力。细胞学为HPV DNA阳性分流的常用手段，但是细胞学已不是目前唯一的首选分流手段。HPV E6/E7mRNA可从癌基因表达活跃状态层面上分流病毒，不亚于细胞学分流，大量临床研究表明mRNA用于分流HPV DNA 阳性患者是可靠且受益的[18]。目前ASCCP和妇科肿瘤学会对HPV mRNA用于HPV阳性和或细胞学异常患者的进一步分流已达成共识[13]。

有报道HPV E6/E7mRNA可用于宫颈高级别病变或癌变的治疗后监测。赵志强等人研究了HPV mRNA在监测高级别上皮病变患者宫颈锥切术后残留和复发的诊断价值，文章表明随访期间检测HPV E6 / E7 mRNA可及时有效预测宫颈病变或癌变术后CIN残留和复发的风险，减少了过度检查和治疗，但是HPV mRNA仅可作为短期预后监测指标，不适合作为长期预后监测指标，具体有待更多的大样本前瞻性研究[19]。

可见HPV E6/E7mRNA在疾病的筛查、分流等方面，比细胞学和HPV DNA优势更大，且其表达水平的高低可能协助病变诊断及复发监测。但是由于技术方法等原因，HPV mRNA、细胞学及HPV DNA 检测都存在交叉反应这一缺点。有报道在年龄≥30岁的宫颈筛查中，不管何种检测，交叉反应占到假阳性检测结果的四分之一，具体数据仍需要更多的临床观察研究。交叉反应是必须解决的，因为该技术缺点增加了患者额外费用和负担。

四、HPV E6/E7mRNA疫苗展望

HPV疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗，其中预防性疫苗的研究应用较成熟，主要以HPV L1蛋白聚合形成的类病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)诱导机体产生特异性抗体为主[20]。目前有3种预防性疫苗获得FDA批准上市并在全球逐渐应用推广，分别为Gardasil四价疫苗，Cervarix二价疫苗，Gradsil九价疫苗[21]。

相对于预防感染，临床中面临更多的是已被感染或已病变的患者，因此治疗性疫苗的开发显得更为迫切。治疗性疫苗的类型很多，包括肽类疫苗、病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗及细胞相关疫苗等，主要通过特异性抗原来诱导细胞、体液免疫反应来达到减灭被感染细胞或肿瘤细胞的目的[22]。由于具体机制复杂，目前大多都处于实验阶段或临床前研究阶段。近年来有学者开始聚焦mRNA分子在疫苗方面的探索，Mleczek等人的研究揭示mRNA抗原具有双重活性可诱导自适应免疫反应、效力高和容易修饰等特点，现已有在非小细胞肺癌、前列腺癌等中以mRNA为抗原制备相关疫苗的研发，因此有学者从理论上推测HPV mRNA在宫颈癌的疫苗及免疫药物治疗方面同样有价值[23]。有研究者将DNA和mRNA转染的小鼠树突细胞作为针对HPV16 E7蛋白的潜在疫苗的比较，实验表明mRNA可使树突状细胞(dendritic cells ，DC)的主要抗原迁移，在用mRNA转染的DC免疫的小鼠中发现最高频率的E7特异性CTL，说明了mRNA可增强机体免疫杀伤反应，经过mRNA修饰的DCs更有助于对抗HPV相关病变[24]。由于目前可检索到有关HPV mRNA疫苗方面的文献研究甚少，具体机制和可行性有待学者们的探索。

五、总结

HPV疫苗和HPV筛查是近十年余宫颈癌防治领域最重要的成就，有望彻底改变宫颈癌高发病率和死亡率的现状。HPV E6/E7mRNA是指示病毒基因复制转录处于活跃状态的分子标志物，在准确性和相关性方面比HPV DNA和细胞学对病变的指示性更好，显示了宫颈癌新的筛查前景，有望成为宫颈癌初筛的首选，但这一期望仍需大规模、多中心、前瞻性的临床研究来验证。同时希望未来能有更多基础研究，为疫苗方面提供思路和方向。

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