宫颈癌是女性发病率较高的生殖系统恶性肿瘤，手术联合术后放化疗是临床应用最多的治疗方案，但针对不同病情特点的患者、治疗方案存在差异[1]。Ezrin蛋白是近来研究较多的参与肿瘤增殖、侵袭转移的相关蛋白，已经有研究明确其在胃癌、肺癌、食管癌肿瘤组织中呈异常高表达，且有学者认为存在Ezrin蛋白高表达的患者预后不佳[2-3]。关于Ezrin蛋白在宫颈癌组织中的表达研究目前已经有所开展，但结果多局限于其表达量的变化，对Ezrin蛋白改变与肿瘤恶性行为间的内在联系研究涉及不多。本文对比宫颈癌组织、癌旁组织中的Ezrin蛋白表达情况，并进一步探讨Ezrin蛋白表达阳性与肿瘤增殖、侵袭活性间的内在联系。
对象与方法
1.对象：选取2013年2月—2016年1月在本院接受手术治疗的宫颈癌患者90例，经组织病理学检查确诊疾病、患者本人及家属均签署知情同意书。入组患者年龄41～70岁，平均(58.3±9.1)岁，肿瘤FIGO分期Ⅰ期26例、Ⅱ期45例、Ⅲ期19例；局部淋巴结转移阴性32例、阳性58例。入组标准为(1)首次确诊疾病、术前无放化疗史；(2)既往无宫颈疾病(炎症等)手术史。排除标准为(1)合并其他组织脏器恶性肿瘤性疾病；(2)伴严重心肝肾功能不全；(3)伴严重自身免疫性疾病。
2.蛋白免疫组化：术中所得肿瘤组织、癌旁组织均置于4%甲醛溶液(上海博谷生物科技有限公司，货号PT028)中固定，石蜡包埋后行连续切片(4.0 μm)、常规行脱蜡及水化。按照S-B试剂盒操作说明进行样本DAB显色，肿瘤样本的不同切片中分别加入1：200稀释的兔来源的Ezrin、p53、NF2、HDAC1、TUG1、Twist、Rab11多克隆抗体(美国Abcam公司，货号PAJ01、批号20140721)、癌旁组织样本中加入PBS液(南京森贝伽生物科技有限公司，货号J373-4L，批号20141119)。在光学显微镜下进行图像摄影，记录并观察染色结果。染色得分标准[4]为(1)染色强弱。0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；(2)阳性细胞比例。0分为<5%，1分为5%～10%，2分为10%～50%，3分为50%～75%，4分为≥75%。计算染色强弱评分与阳性细胞比例评分的乘积。
3.统计学处理：应用SPSS21.0统计分析软件，癌旁组织、宫颈癌组织两组间比较采用成组t检验；相关性分析采用Pearson检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.Ezrin蛋白表达：宫颈癌组织中Ezrin蛋白乘积(8.9±1.1)，癌旁组织中Ezrin蛋白乘积(0.8±0.1)。宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达与肿瘤增殖活性的关系：宫颈癌组织中，增殖相关蛋白p53、NF2表达量均低于癌旁组织，Nanog表达量高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1不同宫颈组织中增殖相关蛋白积分比较
注：与癌旁组织比较，*P<0.05
3.宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达与肿瘤侵袭活性的关系：宫颈癌组织中，侵袭相关蛋白HDAC1、TUG1、Twist、Rab11的表达量均高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2不同宫颈组织中侵袭相关蛋白积分比较
注：与癌旁组织比较，*P<0.05
4.相关性分析：经Pearson检验发现，宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达量与肿瘤增殖相关蛋白p53、NF2的表达量呈负相关(r=-0.6、-0.7，P<0.05)，与Nanog的表达量呈正相关(r=0.7，P<0.05)；与侵袭相关蛋白HDAC1、TUG1、Twist、Rab11的表达量呈正相关(r=0.5、0.6、0.6、0.7，P<0.05)。
讨论
Ezrin蛋白属于细胞骨架与细胞膜间的连接蛋白，可调节细胞-细胞、细胞-细胞外基质的黏附，减少细胞表面E-cadherin表达而促使细胞脱落，聚集于CD44胞质区而导致细胞骨架重建[5]。国内外较多研究发现Ezrin蛋白在胃癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中呈异常表达，通过参与肿瘤细胞吞噬、信号传导途径等影响肿瘤发生发展。本次研究中，宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达量高于癌旁组织，证实在宫颈癌组织中存在Ezrin蛋白的异常表达，参与宫颈癌的发生发展。有研究认为，阳性表达的Ezrin蛋白是恶性肿瘤患者预后不良的标志，但目前关于Ezrin蛋白表达强度与肿瘤增殖、侵袭等恶性行为程度间的直接相关关系研究甚少。无限增殖是恶性肿瘤细胞的最主要特征之一，也是肿瘤体积增加、远处转移发生的物质基础，检测相关增殖基因表达量可量化反映肿瘤增殖活性[6-7]。p53、NF2均属抑癌基因，其表达减少甚至缺失是多种肿瘤发生的主要原因，杨杏[8]的研究也指出p53、NF2基因甲基化后，宫颈癌病情持续进展。Nanog是维持胚胎干细胞自我更新的必需调控因子，大量研究显示其过表达于肿瘤细胞的转移直接相关。于爱清等[9]的研究证实，Nanog基因表达下调可减弱宫颈癌Hela细胞的恶性行为。本次研究对比不同宫颈癌组织中上述增殖相关蛋白表达积分差异，发现与癌旁组织比较，宫颈癌组织中p53、NF2表达量较低，Nanog表达量较高，说明宫颈癌组织中存在增殖/抗增殖相关蛋白的表达紊乱。进一步采用Pearson检验发现，宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达量与p53、NF2表达积分呈负相关，与Nanog表达积分呈正相关，证实Ezrin蛋白高表达可导致宫颈癌细胞增殖活性增强。
侵袭是恶性肿瘤细胞远处转移、患者最终死亡的最直接原因，其本质基础是侵袭相关基因的异常表达[10]。HDAC1、TUG1、Twist、Rab11均属侵袭基因，且在不同研究中被报道与宫颈癌的进展相关。HDAC1可上调NF-κB基因表达、降低组蛋白乙酰化水平，故造成宫颈癌细胞侵袭能力增强[11]；TUG1是p53的重要调控分子，在宫颈癌中也被发现其表达上调，可降低Hela细胞的凋亡能力；Twist是调控上皮间质转化的重要转录因子，被发现在前列腺癌、食管癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中表达上调[12]；阚岩岩等[13]的研究指出，下调Rab11基因表达可抑制宫颈癌SiHa细胞迁移及侵袭。本次研究对比不同宫颈癌组织中上述侵袭相关蛋白表达积分差异，发现与癌旁组织比较，宫颈癌组织中HDAC1、TUG1、Twist、Rab11的表达量较高，说明宫颈癌组织中存在促侵袭相关蛋白的异常高表达。进一步采用Pearson检验发现，宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达量与HDAC1、TUG1、Twist、Rab11的表达积分呈正相关，证实Ezrin蛋白高表达可导致宫颈癌细胞侵袭活性增强。
综上所述，宫颈癌组织中Ezrin蛋白表达阳性率及阳性强度均增加，且Ezrin蛋白表达阳性强度与肿瘤细胞增殖、侵袭活性呈正相关关系。检测Ezrin蛋白表达可以成为判断宫颈癌病情、指导临床治疗的可靠手段。
参考文献
1 葛艳，刘福民，刘永利，等.TGF-β1与Foxp3蛋白在宫颈癌组织中表达意义及相互关系.中国生育健康杂志,2015,26:27-30.
2 崔张霞.紫杉醇联合顺铂方案对局部晚期宫颈癌患者MACC1及Ezrin蛋白表达的影响.现代医学,2017,45:59-62.
3 Kong J,Di C,Piao J,et al.Ezrin contributes to cervical cancer progression through induction of epithelial-mesenchymal transition.Oncotarget,2016,7:19631-19642.
4 李丹,谢珊艳,刘怡安.Ezrin蛋白在宫颈癌中表达及其临床意义.中国妇幼保健,2015,30:775-778.
5 奚美丽,李俊,鹿欣.Ezrin蛋白在宫颈癌中表达的临床意义及其与PCNA、MMP-2、MMP-9、HPV E6蛋白的关系.中国癌症杂志,2013,23:904-907.
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7 Hu J,Liu J,Chen A,et al.Ino80 promotes cervical cancer tumorigenesis by activating Nanog expression.Oncotarget,2016,7:72250-72262.
8 杨杏.p53和NF2基因甲基化在宫颈癌中研究进展.现代妇产科进展,2016，25：862-865.
9 于爱清，李成林，杨毅，等.TALENs介导的Nanog基因表达下调对宫颈癌Hela细胞恶性行为的影响.四川大学学报(医学版),2016,47:23-27.
10 Liu D,Zhou P,Zhang L,et al.HDAC1/DNMT3A-containing complex is associated with suppression of Oct4 in cervical cancer cells.Biochemistry (Mosc),2012,77:934-940.
11 Wang D,Li Q,Li K,et al.Twist-related protein 1-mediated regulation of mesenchymal change contributes to the migration and invasion of cervical cancer cells.Oncol Lett,2015,10:3107-3112.
12 田琴.宫颈癌及癌前病变组织中Twist及TB-1基因表达及与细胞侵袭的相关性.海南医学院学报,2017,23:437-440.
13 阚岩岩,张建华,周敏,等.下调Rab11基因对宫颈癌HeLa/SiHa细胞侵袭迁移的影响及机制探讨.中国癌症杂志,2016,26:238-245.