不孕症的病因有诸多，如合并生殖道感染、多次流产史[1]。近年来，罹患不孕不育症的人数呈逐年增长趋势。据WHO估计，全球约有近6 000万～8 000万人罹患不孕症，约占育龄人口的13.0%～15.0%，且发展中国家的发病率远远高于发达国家[2]。研究发现一系列的感染与流产、死胎和早产有关，其中约15%的早期流产和66%的晚期流产由感染引起[3]。而多次流产本身又是不孕症的主要原因之一，因其可导致输卵管堵塞的概率增大，从而造成继发性不孕症[4]。本研究通过对我院门诊不孕症女性人群生殖道感染微生物检出的情况进行汇总和回顾性分析，并与普通体检女性人群比较，探讨生殖道感染与女性不孕之间的关联性。
对象与方法
1.对象：标本来源于2015年1月—2016年9月上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院微生物室收集的生殖道标本，试验组采样均来自我院辅助生育和不孕症门诊的女性患者，共纳入16 244人；对照组为同期我院常规健康体检的女性，共纳入35 952人。
2.采集方法：采用阴道宫颈拭子取样。用无菌润滑剂的扩张器使宫颈可见，用拭子擦去宫颈外溢的粘液分泌物，丢弃拭子，用另一支无菌拭子插入宫颈内2 cm，旋转拭子，停留2秒，拭子避免碰及阴道壁。取分泌物之前应避免性生活、阴道冲洗和用药。标本采集后应正确盖好，防止泄漏或容器外部留有残留物。所有标本均于采集后2 h内常温送至实验室，进行微生物学检测。
3.实验室检测
(1)一般菌培养：接种血琼脂平板，35 ℃培养18～24 h，观察各类平板上菌落形状后行细菌属、种、型的鉴定。本文中罗列的常见菌属有链球菌属(如无乳链球菌、巴氏链球菌等)、肠杆菌属(如大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌等)、肠球菌属(如粪肠球菌等)。如同一平板超过三种形态菌落生长则不予鉴定。阴道加德纳菌是一种革兰氏染色阴性或染色不定、厌氧、嗜血的病原菌。若在观察血平板时发现有阴道加德纳菌就做菌种鉴定，并结合标本直接涂片革兰染色进行Nugent评分确认，最终报告阴道加德纳菌是否生长。Nugent诊断标准：半定量评估阴道分泌物中3组优势菌(乳杆菌、阴道加德纳菌或拟杆菌、动弯杆菌)的形态分值之和，达7～10分即可考虑为细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)。
(2)念珠菌培养：接种科玛嘉显色平板，35 ℃培养18～24 h。菌落或光滑或较粗糙，不同颜色显示不同菌种：绿色提示为白色念珠菌；紫色提示为光滑假丝酵母菌；蓝色提示为热带假丝酵母菌；粉红提示为克柔假丝酵母菌；白色提示为需进一步上机鉴定其他菌种如近平滑假丝酵母菌、无名假丝酵母菌等。
(3)生殖道支原体检测：采用上海奥普生物医药有限公司提供的泌尿生殖道病原性支原体培养鉴定与计数参考诊断试剂盒，用于检测解脲支原体(Uu)和人型支原体(Mh)。加样后石蜡油封存，37 ℃放置48 h后准时观察加样孔培养基颜色。若孔1、3变色，则考虑Mh感染，且菌量浓度≥104CCU/ml。若孔1、2、4变色，则考虑Uu感染，且菌量浓度≥104CCU/ml。若孔1～5均变色，则考虑同时感染Uu、Mh，且两者菌量浓度均≥104CCU/ml。其余情况或只要孔1不变色，则菌量浓度<103CCU/ml。
(4)沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,Ct)抗原测定：采用艾博生物医药提供的沙眼衣原体抗原检测试剂盒，加样后10～20分钟观察检测区与质控区是否显现红色条带。结果判定如下：阳性为两条红色条带出现，表明样本内含有衣原体抗原；阴性为仅质控区显色，而检测区未显色，表明样本检测不出衣原体抗原或是含量低于可检测范围。在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判为阳性结果。
4.统计学处理：数据经Microsoft Office Excel 2003录入及分类汇总，采用SPSS 20.0软件分析。组间比较采用χ2检验，组内比较采用二项分布,P<0.05为差异有统计学意义。
结果
不孕症女性生殖道微生物检出阳性者1 555例，普通健康体检女性中生殖道微生物检出阳性者783例，生殖道感染在不孕女性和体检女性中检出率分别为9.6%和2.2%，统计学差异显著，见表1。其中不孕女性生殖道检出病原体前3位依次为支原体、念珠菌、衣原体，与体检组相比统计学差异显著；体检女性生殖道检出前3位病原体依次为支原体、念珠菌、链球菌属。详见表2。
不孕症女性生殖道支原体检出率为8.3%，位居首位，检出率远高于其他菌属，差异有统计学意义。其他检出病原体为(按菌种、菌型分类)：念珠菌119人(包括白假丝酵母菌56人、光滑假丝酵母菌56人、近平滑假丝酵母菌3人、热带假丝酵母菌3人、无名假丝酵母菌1人)；衣原体103人；链球菌5人，均为无乳链球菌(B群)；肠杆菌4人(大肠埃希菌2人、肺炎克雷伯氏菌2人)；肠球菌3人，均为粪肠球菌(D群)。另用一般菌培养法检出阴道加德纳菌4人。
表1不孕与体检女性生殖道标本检出阳性情况
*两组比较，P<0.001
表2两组女性生殖道感染微生物检出情况，按菌属分类[例(%)]
普通健康体检女性生殖道支原体检出率为2.1%，位居首位，检出率高于其他菌属，差异有统计学意义。其他检出病原体为(按菌种、菌型分类)：念珠菌17人(包括白假丝酵母菌9人、光滑假丝酵母菌6人、近平滑假丝酵母菌2人)；链球菌11人(无乳链球菌(B群)10人、巴氏链球菌1人)；衣原体8人；肠杆菌4人(大肠埃希菌2人、肺炎克雷伯氏菌2人)；肠球菌2人，均为粪肠球菌(D群)。另用一般菌培养法检出阴道加德纳菌1人。
因此，在同等检测条件下观察到无论不孕症与普通体检女性，导致其生殖道感染的首位病原体均为生殖道支原体，其检出量由多及少均为Uu>Uu+Mh>Mh。但是不孕组感染支原体的总体比例和Uu、Uu+Mh的构成比均明显高于体检组，体检组感染Mh的患者合并其他病原体的感染的比例明显高于不孕组，统计学差异显著。见表3、表4。
表3两组女性生殖道标本支原体检出的比例
*不孕组和体检组比较，P<0.001
表4不孕组和体检组生殖道支原体感染人群中检出类型构成比[例(%)]
*不孕组和体检组单纯感染组比较，P<0.001；#不孕组和体检组合并其他类型比较，P<0.001
讨论
本文调查的结果提示，跟普通体检女性相比，不孕女性的生殖道更容易出现生殖道支原体、念珠菌、沙眼衣原体的感染，其中支原体感染率明显领先，均为Uu>Uu+Mh>Mh，且以单纯感染Uu或Uu+Mh居多。合并生殖道感染及多次流产等均可致不孕，且某些生殖道感染又与流产间有正相关性，可致继发性不孕。那么是这些病原体感染直接导致了不孕的发生，还是通过导致复发性流产再继发不孕的呢？下面就本次调查发现的不孕女性生殖道排名前三的病原体分别为生殖道支原体(Uu、Mh)、念珠菌、沙眼衣原体展开讨论。
2016年一篇meta分析对2009—2014年期间所有以“流产”、“感染”为关键词，圈定对象为人、使用英文发表的临床试验，并排除了动物试验与个案病例报道，共有327篇论著，其中有44篇研究观察了不同病原体与流产之间的关联，包括细菌感染、病毒感染、原虫感染三种。其中与流产有显著相关的为细菌性阴道炎(包括人型支原体和解脲支原体)、布鲁杆菌病、梅毒、巨细胞病毒、黄病毒、HIV、风疹病毒、疟疾。有些严重的母体感染，例如流感、HIV、登革热和疟疾，母体的应答或许会导致流产而非直接的胎盘感染[3]。Allanson B等[5]对101名孕妇研究发现，采样(绒毛膜、羊膜、脐带)中有25%为流产的标本检出Uu阳性；其次检出的常见病原体为Mh和B族链球菌，约11%。而所有对照组孕妇均未发现有感染，提示即使本身能受孕的妇女处于妊娠期内，如感染Uu、Mh后易流产、继而致不孕。Rajkumari N等[1]开展一项前瞻性的临床研究，对象为100对不孕症女性与有健康生育力的女性，取其首段尿、宫颈内拭子、子宫内膜活检标本，行PCR检测生殖道支原体，证实了北印度人群的不孕症与生殖道支原体感染呈正相关，并建议孕前应常规筛查该病原体。提示生殖道支原体可能在不孕症女性体内长期且多部位生存。而2016年发布的中国生殖道支原体感染诊治的专家共识中明确提及根治解脲支原体相当困难，这可能与药物在阴道酸性环境下失活以及对临床中常用的红霉素、林可霉素、四环素等耐药有关[6]。
本研究中无论不孕组女性还是体检组女性，其生殖道感染的第二位病原体均为念珠菌，而我院2009—2014年住院和门诊患者的分离菌中共有白念珠菌439株(6.9%)，位列第四，且主要标本来源于生殖道[7]。可见念珠菌感染在女性生殖道感染中的重要地位，且很可能与不孕症的发生相关。唐晓华等[8]于2014年发表一篇采集不孕妇女阴道分泌物样本，采用科玛嘉念珠菌显色培养基做培养鉴定，结果收集的454例样本中共分离出86株念珠菌，其中占前三位的为白念珠菌48株(55.8%)、光滑念珠菌24株(27.9%)、热带念珠菌8株(9.3%)。所幸的是针对念珠菌的临床治疗效果比较满意，根据我院2009—2014年分离菌的耐药分析提示氟康唑的敏感率可达86.0%～94.0%[7]。
本次调查研究所得不孕症女性生殖道衣原体的感染率达到0.6%(103/16 244)，不仅远高于本研究中体检组女性的感染率，也远高于中国性病监测点报道2015年我国Ct感染报告发病率37.18/10万[9]。表明Ct感染在不孕症女性的发病中极有可能扮演着重要的角色。但是根据前述Giakoumelou S的Meta分析总结可得出衣原体感染与继发性不孕的最常见病因“流产”之间并不相关。其他的研究诸如：Abdella RM等[10]使用ELISA法及RT-PCR技术来标准化血清学检测原因不明的不孕女性衣原体感染阳性率高达40%；丁楠等[11]的meta分析发现单纯的Uu或是Ct感染与女性不孕症相关。综上所述，均提示Ct感染与不孕症的发生确是息息相关的，但是具体通过哪条途径(是直接病因还是间接致病)现在尚未发现其确切的致病机制。但是，对整个人口水平而言，防控女性感染后远期合并症才是生殖道沙眼衣原体感染最重要的责任[12]。可见Ct感染后所致的输卵管粘连等可能对排卵受孕这一基本前提条件造成持续性破坏，有必要对Ct做到早干预、早发现、早治疗。
本研究中采用一般菌培养法在两组中阴道加德纳菌检出率都很低。但因普通健康体检套餐项目包含BV快速试验，本次调查中体检组所有标本均额外检测BV快速试验感染阴道加德纳菌(采用郑州安图绿科公司生产的细菌性阴道病联合测定试剂盒；根据唾液酸酶结果判定：检测孔颜色变蓝色或绿色，为阳性；不变色，为阴性)。与一般菌培养法所得出的结论不同，体检组中测得唾液酸酶阳性者占6.2%(2 224/35 952)(单纯BV阳性2 108人、合并其他感染116人)。这可能与上述两种阴道加德纳菌检测方法不同的特异性和敏感性有关。但无论如何，不难看出阴道加德纳菌扮演着普通女性生殖道
环境内的重要角色。正常健康女性的生殖道菌群绝大部分为乳酸杆菌，另一部分为潜在的可能产生毒力的微生物例如阴道加德纳菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌、解脲支原体和人型支原体，致病时取代了阴道内的乳酸杆菌优势菌群地位，导致细菌性阴道病[3]。实际临床工作中可通过BV快速试验检测唾液酸酶来判定是否感染阴道加德纳菌[13]。遗憾的是，本文中辅助生育和不孕症门诊的女性患者未常规筛查该项目，故阴道加德纳菌感染是否与本地区不孕症发生相关有待进一步完善研究去证实。
生殖道感染无论对健康女性或不孕人群来说，都是不容忽视的健康问题。从本研究结果来看，不孕人群比普通体检人群生殖道感染率显著增高，极有可能是影响不孕人群生育力的高危因素，应继续推行生殖道病原体的常规筛查，并针对性进行相应治疗。
参考文献
1 Rajkumari N,Kaur H,Roy A,et al.Association of Mycoplasma genitalium with infertility in North Indian women.Indian J Sex Transm Dis,2015,36:144-148.
2 冉利梅,宋珏,沈璐,等.不孕症管理的研究进展.中华健康管理学杂志,2013,7:256-258.
3 Giakoumelou S,Wheelhouse N,Cuschieri K,et al.The role of infection in miscarriage.Hum Reprod Update,2016,22:116-133.
4 金筱筱,郑灵芝,张紫娟.人工流产术后输卵管堵塞继发不孕的临床研究与感染分析.中华医院感染学杂志,2015:1879-1881.
5 Allanson B,Jennings B,Jacques A,et al.Infection and fetal loss in the mid-second trimester of pregnancy.Aust N Z J Obstet Gynaecol 2010,50:221-225.
6 张岱,刘朝晖.生殖道支原体感染诊治的专家共识.中国性科学,2016,25:80-82.
7 仓艳琴,李美玲,陆庭嫣,等.2009-2014年上海某妇幼保健院分离菌分布特点及耐药性分析.中国感染与化疗杂志,2017,17:404-412.
8 唐晓华,江镜全,叶俊凯,等.不孕妇女阴道念珠菌病致病菌分析.检验医学,2014:115-117.
9 岳晓丽,龚向东,滕菲,等.2008-2015年中国性病监测点生殖道沙眼衣原体感染流行特征分析.中华皮肤科杂志.2016.49:308-313.
10 Abdella RM,Abdelmoaty HI,Elsherif RH,et al.Screening for Chlamydia trachomatis in Egyptian women with unexplained infertility,comparing real-time PCR techniques to standard serology tests:case control study.BMC Womens Health,2015,15:45.
11 丁楠,王芳,简启亮,等.解脲支原体、沙眼衣原体感染与女性不孕症相关性的meta分析.中国计划生育学杂志,2014,22:803-807.
12 Hoenderboom BM,van Oeffelen AA,van Benthem BH,et al.The Netherlands Chlamydia cohort study (NECCST) protocol to assess the risk of late complications following Chlamydia trachomatis infection in women.BMC Infect Dis.2017,17:264.
13 黄伟忠,张莉,张扬,等.加德纳菌感染流行病学调查及实验室快速检测方法评价.中国热带医学,2015,15:1198-1200,1216.