不孕症妇女血清中稀土元素与体外受精-胚胎移植结局的关联性研究

【摘要】目的探讨行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妇女血清中稀土元素含量与IVF-ET结局的关联性。方法本研究于2016年10月至2017年5月在北京大学人民医院采用前瞻性巢式病例对照研究的方法共募集84名患有不孕症并且实施IVF-ET的妇女。通过问卷调查研究对象社会人口学信息，从病历记录中获取其IVF-ET相关临床信息。在进入IVF-ET治疗周期前采集研究对象空腹静脉血，B超诊断IVF-ET治疗周期后临床妊娠情况。临床妊娠失败的研究对象归为妊娠失败组，成功获得临床妊娠的研究对象归于妊娠组。采用电感耦合等离子体质谱仪定量血清中15种稀土元素浓度，以稀土元素浓度的中位值分为高低浓度组，其中镥元素浓度≤ 2.2 pg/ml作为低浓度组，镥元素浓度> 2.2 pg/ml作为高浓度组。结果行IVF-ET后，临床妊娠失败38名，获得临床妊娠46名。妊娠失败组血清镥元素浓度中位数(P25，P75)[2.7 (1.8，3.3)pg/ml]显著高于妊娠组 [2.0 (1.3，2.8)pg/ml] (P< 0.05)，其他元素两组分布差异均未见统计学意义。相比于镥元素较低浓度组(≤ 2.2 pg/ml)，镥元素较高浓度组(> 2.2 pg/ml)粗比值比OR(95%CI)[3.3 (1.3～8.1 ) ]，调整比值比OR(95%CI)[4.1 (1.5～10.9) ]。相比于血清镥元素浓度较低的研究对象，镥元素浓度较高的研究对象行IVF-ET失败的概率是其4.1倍。结论不孕症妇女血清中高浓度镥元素可能是造成行IVF-ET失败的危险因素之一。

体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)是治疗不孕症的有效方法，但仍有部分妇女行IVF-ET后仍无法获得妊娠结局。IVF-ET结局受多方面因素的影响，例如妇女年龄、卵巢储备功能、疾病、胚胎质量、移植技术等[1-4]。据报道，IVF-ET结局也可能与重金属暴露有关[5-6]，目前有关稀土元素与IVF-ET结局的关联性的研究未见有报道。中国是世界稀土资源储量大国，稀土元素的过量开发可能引起人群对稀土元素的摄入量增加。稀土元素包括元素周期表中的镧系元素(镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥)以及与之密切相关的钪和钇两种元素。稀土元素可分为轻稀土元素(铈组，包括镧、铈、镨、钕、钷、钐和铕)和重稀土元素(钇组，包括钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钪和钇)[7]。稀土元素对神经系统、内分泌系统、免疫系统和生殖系统均可能会产生毒性作用，其生物学毒效应已引起广泛关注[8]。研究发现，镧、铕可抑制大鼠精子活力[9]；镧可使血睾屏障功能失调，影响睾丸间质细胞分泌睾酮，并可引起精子畸形率上升[10]；铈可致小鼠精子畸形率升高[11]。因此，本文旨在分析稀土元素对IVF-ET结局的影响，为筛选影响IVF-ET结局的环境暴露因素提供一定的理论依据。

对象与方法

一、研究对象

本研究采用前瞻性巢式病例对照研究设计，于2016年10月到2017年5月在北京大学人民医院募集研究对象。研究对象为首次在医院进行IVF-ET的妇女，须符合下列募集条件：(1)年龄 ≤ 40岁；(2)18.5 kg/m2≤ BMI ≤ 28 kg/m2；(3)不孕时间≥ 1年；(4)因输卵管因素或男方因素而助孕者(输卵管因素为Ⅰ型，男性因素为Ⅱ型，输卵管因素合并男性因素为Ⅲ型)；(5)进入IVF-ET治疗周期前3个月内没有接受过任何甾体类药物治疗。研究对象排除标准：(1)存在输卵管积水；(2)子宫腺肌病；(3)甲状腺功能异常；(4)高催乳素血症；(5)糖尿病(I型和II型)；(6)严重的心血管疾病等，不适于妊娠者。如果妇女符合募集条件，则向其介绍研究内容。当妇女同意参加并且签署了“知情同意书”，则可进入队列研究。妇女进入IVF-ET周期前通过问卷调查研究对象的社会人口学信息，通过病历记录获取IVF-ET相关的临床信息，在研究对象进入IVF-ET治疗周期前一天采集空腹静脉血样品，分离出血清。首次胚胎移植4周后B超确定是否临床妊娠。临床妊娠失败的研究对象归为妊娠失败组，成功获得临床妊娠的研究对象归于妊娠组。本研究共募集89名研究对象，剔除5位未能有效提供血液标本的研究对象，剩余84例研究对象被纳入分析。该研究获北京大学人民医院伦理委员会批准。

二、方法

1.超排卵方案与结局：根据研究对象的年龄、基础内分泌水平、窦卵泡数及合并疾病的特征，如体重指数(BMI)、卵巢或输卵管手术史等，选择合适的方案和启动剂量。超排卵方案包括拮抗剂方案(方案Ⅰ)、短方案(方案Ⅱ)和长方案(方案Ⅲ)。拮抗剂方案是在月经第二天启动，阴道B超定期监测卵泡的生长，并根据卵泡生长情况调整促性腺激素的使用剂量。当最大卵泡直径达1.4 cm时，每日注射促性腺激素拮抗剂0. 25 mg(注射用醋酸西曲瑞克，商品名: 思则凯，0.25 毫克/支)至卵泡成熟。当双侧卵巢内至少有2个以上直径大于18 mm的卵泡时，使用人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)激发排卵。短方案也是在月经第二天启动，同时使用促性腺激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa)和促性腺激素(gonadotropins, Gn)。长方案是上一周期黄体中期使用GnRHa 1.25 mg，月经第2～4天启动。在注射激发排卵药物后36 h左右取卵，回收卵母细胞，根据精液情况采用IVF /卵细胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)授精。取卵3 d后进行胚胎移植，14 d 后检测血β-hCG >25 IU/L诊断为生化妊娠，超声见到胎囊、卵黄囊诊断为临床妊娠。全胚胎冷冻者，择期行胚胎移植。

卵裂期胚胎评级综合了卵裂速度、卵裂球均等程度及碎片比例，分为4级[12]。其中，I级胚胎即优质胚胎：受精后第2天细胞数4～6个，第3天6～10个，卵裂球均等或略不均等，碎片≤15%；II级胚胎：细胞数未达到I级标准或碎片比例< 30%；III级胚胎：碎片比例< 50%；IV级胚胎：碎片比例≥50%。如果卵裂球大小差异明显，降为下级胚胎；发育阻滞胚胎评为IV级胚胎；可利用胚胎指I级和II级胚胎。囊胚评分参见Garder评分系统，根据囊胚的扩展和孵出情况分为1～6级，3～6级囊胚分别再对内细胞团和滋养外胚层分为A、B、C级[13]。

2.血清中稀土元素分析：本研究一共测定了血清中15种稀土元素的含量，包括镧(lanthanum)、铈(cerium)、镨(praseodymium)、钕(neodymium)、钐(samarium)、铕(europium)、钆(gadolinium)、铽(terbium)、镝(dysprosium)、钬(holmium)、铒(erbium)、铥(thulium)、镱(ytterbium)、镥(lutetium)和钇(yttrium)。用1%的硝酸将血清稀释20倍，充分混匀后用电感耦合等离子体质谱仪(型号：DRC-II，美国Perkin Elmer公司)定量分析血清中稀土元素含量。质谱仪工作参数如下：雾化气流量，0.9 L/min；辅助气流量，1.5 L/min，等离子体气流量流，15.0 L/min；射频发生器功率，1 170 W；驻留时间：100 ms；样品提升量，1.1 ml/min；扫描方式，单点跳峰；分辨率，0.7～0.9 aum。实验分析工作由北京大学生物医药卫生分析中心完成，相关操作流程通过中国计量认证(China metrology accreditation, CMA)批准通过。使用稀土元素浓度中位数值将人群分为高低浓度组，其中镥元素浓度≤ 2.2 pg/ml作为低浓度组，镥元素浓度> 2.2 pg/ml作为高浓度组。

3.统计学处理：应用SPSS 21.0软件进行数据分析。采用Pearson卡方检验两组人群分布差异。人群血清中稀土元素浓度不呈正态分布，因此采用Mann-Whitney U检验比较大小差异。采用Logistic回归分析血清中稀土元素与IVF-ET结局的关联，用比值比(odds ratio，OR)指示稀土元素可能导致IVF-ET失败的风险。检验显著性水平为P<0.05。

结果

一、人群特征

在有效募集的84名研究对象中行IVF-ET后，临床妊娠失败有38名(妊娠失败组)，获得临床妊娠成功46名(妊娠组)。表1比较了84名妇女的基本特征。两组妇女在年龄、BMI、文化程度、职业、居住地、是否被动吸烟、不孕病因、超排卵方案、授精方式、胚胎移植周期和数量分布上的差异均未见统计学意义。另外，本研究对相关临床指标进行统计，包括基础窦卵泡数目、基础卵泡刺激素水平、基础促黄体生成素水平、基础雌二醇水平、基础睾酮水平、Gn刺激天数、Gn启动剂量、Gn总剂量、大于13 mm的卵泡数、hCG日促黄体生成素水平、hCG日雌二醇水平、hCG日睾酮水平、hCG日孕酮水平、获卵数、MII期卵母细胞数目、2PN数目、优质胚胎数、HCG日子宫内膜厚度。除大于13 mm的卵泡数外，其他指标两组间差异均未见统计学意义。

表1行IVF-ET的研究对象临床妊娠组和临床妊娠失败组的基本特征比较

Table 1Characteristics of non-pregnant women and pregnant women undergoing IVF-ET [n(%)]

* Total number may not be equal to the number of pregnant or non-pregnant groups due to missing or unknown data

二、血清稀土元素浓度

表2总结了84名研究对象血清中稀土元素总体浓度特征，并比较了妊娠组和妊娠失败组之间分布的差异。两组妇女血清中各稀土元素浓度均不服从正态分布，因此，采用非参数检验比较两组的浓度水平。临床妊娠失败组血清中镥浓度中位数[2.7(1.8, 3.3)pg/ml] 显著高于临床妊娠组[2.0(1.3, 2.8)pg/ml] (P< 0.05)，其他稀土元素组间差异均未见统计学意义。

Table 2Comparison of serum concentrations of the rare earth elements (REEs) from non-pregnant women and pregnant women undergoing IVF-ET [median(P25，P75), pg/ml]

The abbreviations of the fifteen REEs were La (lanthanum), Ce (cerium), Pr(praseodymium), Nd (neodymium), Sm (samarium), Eu (europium), Gd (gadolinium), Tb (terbium), Dy (dysprosium), Ho (holmium), Er (erbium), Tm (thulium), Yb (ytterbium), Lu (lutetium), and Y (yttrium), respectively;*P<0.05

三、与文献比较

表3列出本研究与其他针对人群血清REEs研究文献报道结果。总体来看，本研究妇女血清中镧 [49.9 (40.0, 59.0)pg/ml]、铈[78.7 (65.2, 100.3)pg/ml]浓度水平低于国内另一健康研究人群 [80 (50, 120)pg/ml；150 (90, 240)pg/ml][14]两倍左右，也低于日本的一项关于健康人员血清中REEs含量的研究 [(62.7±7.1)pg/ml；(214.0±22.0)pg/ml][15]。但是本研究妇女血清中钕 [144.2 (109.3, 163.1)pg/ml] 浓度高于中国另一研究人群 [120 (90, 160)pg/ml][14]，也远远高于日本的研究[(33.7 ± 4.2)pg/ml][15]。另外，本研究妇女血清中钐[91.2 (75.3, 114.1)pg/ml]、铕[25.6 (18.9, 31.9)pg/ml]、钆[30.1 (22.8, 41.0)pg/ml]、铽[7.5 (5.5, 9.3)pg/ml]、镝[33.8 (27.5, 44.1)pg/ml]、钬[9.3 (7.4, 11.8)pg/ml]、铒[19.7 (15.7, 26.4)pg/ml]、铥[4.6 (3.3, 6.0)pg/ml]浓度均高于日本的研究报道，而血清中镱[15.4 (12.0, 19.5)pg/ml]、镥[2.2 (1.4, 3.2)pg/ml]浓度与日本的研究报道的浓度水平相当[15]。总体来看，与其他研究相比，本研究人群体内的轻稀土元素浓度处于较低水平，重稀土元素浓度处于较高水平。

四、风险评估

根据本研究人群血清中镥元素浓度的中位数值将人群分为两组，镥元素低浓度组(≤2.2 pg/ml)和高浓度组(>2.2 pg/ml)。表4列出人群血清镥元素浓度与IVF-ET结局关联的剂量反应关系分析结果。相比于镥元素低浓度组，镥元素高浓度组粗OR=3.3 (95%CI: 1.3～8.1)，镥元素高低浓度差异具有统计学意义。当调整年龄、BMI、不孕病因和超排卵方案这些变量后，调整OR=4.1 (95%CI: 1.5～10.9)，镥元素高低浓度差异具有统计学意义。这提示血清中高浓度镥元素可能是造成IVF-ET失败的危险因素之一。

表3不同研究中的人群血清稀土元素浓度比较(pg/ml)

Table 3Comparison between the serum concentrations (pg/ml) of REEs in our study and those of other countries or regions

“—”: Unreported；The abbreviations of the fifteen REEs were La (lanthanum), Ce (cerium), Pr(praseodymium), Nd (neodymium), Sm (samarium), Eu (europium), Gd (gadolinium), Tb (terbium), Dy (dysprosium), Ho (holmium), Er (erbium), Tm (thulium), Yb (ytterbium), Lu (lutetium), and Y (yttrium), respectively.

表4人群血清镥元素浓度与IVF-ET结局的关联

Table 4Association between serum concentration of lutetium and the risk of IVF-ET

aCalculated by using binary Logistic regression;bCalculated by using binary Logistic regression adjusted for maternal age, BMI, pathogenesis type, and treatment protocol.

讨论

本研究采用前瞻性巢式病例对照研究方法考察稀土元素与IVF-ET结局的关联，发现IVF-ET后临床妊娠失败组血清中镥元素浓度水平显著高于妊娠成功组，其他稀土元素浓度在两组人群未见显著差别；血清中镥元素较高组，有较高的IVF-ET失败的风险。总体而言，镥元素可能对IVF-ET结局存在潜在影响，应引起一定关注。

本研究对行IVF-ET后临床妊娠失败和成功两组研究对象的基本特征和临床参数进行了比较，如BMI、文化程度、职业、居住地、是否被动吸烟、不孕病因、超排卵方案、授精方式、胚胎移植周期和数量，发现上述参数在两组分布差异均未见统计学意义，说明混杂因素进行了较好的控制。此外，目前针对妇女血清或者血浆中稀土元素浓度报道相对较少。通过与目前检索到的两项研究报道[14-15]比较,发现本研究人群的轻稀土元素浓度水平稍低，除去镱、镥元素外，其他稀土元素浓度水平较高。本研究报道的血清中稀土元素浓度为将来的研究提供了重要的基础参考数据。

相比于血清镥元素浓度较低的妇女人群，镥元素浓度较高的妇女行IVF-ET失败的概率是其4.1倍，提示血清高浓度镥元素可能是造成IVF-ET结局失败的危险因素之一。目前尚未检索到有关于体内稀土元素水平与IVF-ET结局关联性的研究，对于稀土元素在这一临床过程中的作用机制也尚不清楚。在生物学效应方面，研究证实稀土元素可以影响生物体的内源性激素的分泌，并且存在剂量-反应关系，呈“低促-高抑”的hormesis效应[8]。比如，由不同途径摄入稀土元素后，低剂量时可诱发机体内分泌功能从而使血清中生长激素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素浓度升高，达到一定剂量时则抑制分泌使血清中激素浓度降低[16-17]。摄入一定剂量的稀土元素会抑制机体分泌孕酮[18]。因此，摄入高剂量的稀土元素可能会改变机体的激素水平。有研究认为人hCG日孕酮/雌二醇值对IVF-ET结局起着重要的影响作用[19]。取卵前过高的孕酮/雌二醇比值对胚胎植入不利,而适当的雌孕激素环境才有利于胚胎着床[20]。由此可见，稀土元素有可能通过干扰妇女机体内分泌的平衡，继而对IVF-ET的结局产生潜在影响。

本研究全面测定了血清中各种稀土元素，为以后其他类似的研究提供了参考依据；本研究较好的控制了相关混杂因素以考察稀土元素对IVF-ET关联性的影响。本研究发现血清中高浓度镥元素可能是造成IVF-ET失败的危险因素之一，这对以后的研究方向有一定提示作用。当然，本研究也存在局限性，首先，缺乏对于稀土元素在IVF-ET过程产生影响的作用机制探究，不能很全面地解释本实验结果；其次，血细胞的代谢周期约是120 d，然而稀土元素暴露期可能更长，血液样本可能不能完全反映真实暴露情况。

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Association of serum rare earth elements and the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer among Infertile Women

CHENG Zixi,LU Qun,XIE Jing,LIU Yingying,QIANG Lijuan,YAN Lailai,LI Zhiwen,WANG Bin,ZHANG Jingxu.

Department of Child,Adolescent and Women’s Health,School of Public Health,Peking University,Beijing100191,China

[Abstract]ObjectiveTo study the association between the level of rare earth elements (REEs) of infertile women undergoingin vitrofertilization and embryo transfer (IVF-ET) and the risk of IVF-ET failure.MethodsFrom Oct 2016 to May 2017, we adopted prospectively nested cohort study by recruiting a total of 84 valid women in Peking Univerisity People’s Hospital. A questionnaire was used to collect information regarding socio-demographic features. Clinical information related to IVF-ET was obtained from medical record. Fasting venous blood was collected before the treatment cycle. Clinical pregnancy was diagnosed using B-mode ultrasound after IVF-ET. The subjects of clinical pregnancy failure were classified as non-pregnanct group, and those who obtained clinical pregnancy successfully were regarded as pregnant group. A total of 15 REEs in serum were detected using inductively coupled plasma source mass spectrometer. REEs levels were divided into high and low concentration groups according to their median value (lutecium cut-off concentration: 2.2 pg/ml).Results38 women did not achieve pregnancy after undergoing IVF-ET and 46 women conceived. We found that the serum lutecium concentration in the failure group [median value (P25，P75): 2.7 (1.8, 3.3)pg/ml] was significantly higher than that in the success group [2.0 (1.3, 2.8)pg/ml] (P<0.05). The crude odds ratio [OR(95%CI): 3.3 (1.3-8.1)] and the adjusted odds ratio [adjustedOR(95%CI): 4.1 (1.5-10.9)] for women with high lutecium concentration (>2.2 pg/mL) compared to the reference women with low lutecium concentration (≤ 2.2 pg/mL) were both statistically significant. Women with higher lutecium level in serum was 4.1 times easier to get no pregnant during IVF-ET, compared to those with lower lutecium level.ConclusionHigh level of lutecium in serum may have an adverse effect on the IVF-ET success rate in infertile women.

[Key words]rare earth elements; serum;in vitrofertilization and embryo transfer; infertility

基金项目：国家自然科学基金(41401583)和国家关键技术研发项目(2015BAI13B06)

作者单位：100191 北京，北京大学公共卫生学院妇幼卫生学系(程子茜，张敬旭)；北京大学人民医院生殖医学中心(鹿群，强丽娟)；北京大学生育健康研究所/卫生部生育健康重点实验室(谢婧，刘莹颖，李智文，王斌)，北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系(谢婧，刘莹颖，李智文，王斌)；北京大学公共卫生学院中心实验室(闫赖赖)