缺氧盒在建立新生鼠神经干细胞缺氧细胞模型中的应用

【摘要】目的探讨缺氧盒在建立新生鼠神经干细胞(NSCs)缺氧细胞模型中的应用。方法取2只购自中国人民解放军军事医学科学院、健康、新生1 d、体重分别为8 g、9 g、雌雄不限的SD大鼠海马在无血清培养基进行NSCs原代培养并传代，分为两组。缺氧组通入5% CO2+ 95% N2混合气体，并将培养基更换为无糖培养基，缺氧时间分别为30 min、1 h、2 h，在各时相点观察细胞形态学变化，并进行台盼蓝细胞计数和细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测NSCs细胞活性，后迅速复氧、更换无血清培养基，复氧复糖24 h、72 h。常糖常氧为对照组。结果与对照组比较，缺氧30 min后NSCs死亡细胞数和细胞活性组间差异无统计学意义；缺氧1 h、2 h NSCs死亡细胞数明显增多，NSCs细胞活性明显降低，组间差异有统计学意义；死亡细胞数随着缺氧时间的延长而增多；复氧复糖24 h、72 h后细胞活性降低，差异具有统计学意义。结论缺氧盒可以成功建立新生鼠NSCs缺氧细胞模型。

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有多向分化和自我更新功能，目前NSCs治疗神经系统退行性疾病主要采用NSCs移植和诱导自身的NSCs增殖分化两种方法[1-2]。人类采用NSCs治疗的疾病越来越多，基础研究采用动物和细胞模型模拟人类缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)进行模式研究，目前，有很多建立缺氧NSCs模型的方法[3-4]，但由于不同的研究单位条件不同，有些方法对设备要求高，造价也高，因而不能普遍实用。若能寻找一种要求的设备简单、成本又低、操作简单而有效方法，那将是人类的福气。为此，本研究采用细胞培养及自制缺氧盒等技术，建立新生鼠(sprague dawley，SD)的NSCs缺氧细胞模型，旨在为开展NSCs与HIBD的相关研究提供新思路。

材料与方法

1.材料：健康新生1 d体重分别为8 g、9 g的SD大鼠2只，雌雄不限，购自中国人民解放军军事医学科学院(SCXK-(军)-2012-0004)。95% N2+ 5% CO2的混合气体(北京兆格气体科技有限公司)，兔抗大鼠Nestin单克隆抗体(Santa)、表皮生长因子(EGF)、N2、新生的小牛血清(GibcoBRL)、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、细胞培养基DMEM/F12，SP通用抗体试剂盒，DAB试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)由碧云天公司提供，DMEM无糖培养基(Neuronbc)，其它试剂为国产分析纯；乐扣矩形保鲜盒(HPL825-CHM)，二氧化碳培养箱(SANYO，MCO-18AIC)，迷你离心机(昊诺斯生物科技有限公司，10512425)，摇床(其林贝尔，TS-1000)。

(1)分离SD乳鼠的海马组织。SD鼠用乙醚麻醉，脱颈处死，放入75%乙醇中浸泡消毒，移至超净工作台上，取出海马，将海马组织移入另一只冰浴的盛有D-hank′s液的平皿剪碎吹打，用200目钢丝网过筛，至10 ml试管中，加入0.25%的胰蛋白酶3 ml，放入37℃水浴箱水浴5 min，消化并充分吹打，用胎牛血清终止消化，以1 000 r/min转速，离心8 min，去除上清，留取管底白色沉淀物，即单细胞悬液，台盼蓝活细胞计数。

(2)NSCs体外培养及鉴定。参照文献[2]NSCs体外培养技术、鉴定方法，将获得的单细胞加入含血清培养基，充分吹打混匀，培养24 h后换无血清培养基培养，按5×105/ml细胞密度接种于25 ml培养瓶，37℃，5% CO2孵箱中培养，5～7 d进行传代培养，将传代第3代NSCs一部分按5×105活细胞/毫升的密度接种于25 ml培养瓶，一部分细胞接种于35 mm培养皿中培养，用于免疫细胞化学鉴定。取出细胞爬片放入6孔板内，漂洗，加入4%多聚甲醛溶液、0.5% Txiton X-100 溶液、3%H2O2，血清封闭，加入一抗Nestin(1:100)，阴性对照用PBS代替，放入湿盒37°C孵育1-2 h，加入二抗，DAB显色，镜下观察并摄片。

(3)制作NSCs缺氧细胞模型。缺氧培养盒制作，参照文献[2]，并加以改良，通入的混合气体密度相对较大，因此用钻孔器在保鲜盒上外处(出气孔)、里下位置(进气孔)分别凿1个孔，两个橡胶导管分别插入进出口中，用透明胶带严格固定封闭，进气孔通过吸氧管与湿化瓶连接，再通过橡胶导管与混合气体瓶连接，并用透明胶带严格固定封闭。将传代的NSCs重悬，按密度为5×105活细胞/ml加至一次性培养皿中；缺氧组更换为无糖DMEM培养基，放入自制缺氧盒中；对照组培养基仍不含血清，移入37℃、5% CO2温箱中培养。先用真空棒抽出装置内空气，抽完空气后立即夹住出气孔的橡胶导管，将其轻轻插入测氧仪的氧电极导管，当测氧仪显示氧气浓度<1%时，迅速打开阀门通入95% N2+ 5% CO2的混合气体，调节气体流量为1 L/min，在每个时相点持续通气，通过测氧仪持续监测氧气浓度，根据测氧仪显示氧浓度结果，动态调节通入95% N2+5%CO2的混合气体流量，使测氧仪显示氧气浓度<1%。选择通气体时间30 min、1 h及2 h为检测时相点，在各时相点取出细胞在显微镜下观察细胞形态、台盼蓝细胞计数和CCK-8法检测NSCs细胞活性，复氧同时更换无血清培养基。见图1。

图1 NSCs缺氧细胞模型装置

3.NSCs细胞缺氧模型建立成功标准：缺氧后NSCs数量减少，形态不规则，边界不清楚，折光性减弱，胞体肿胀，甚至出现核固缩、细胞膜破裂；各时相点缺氧组和对照组细胞分别加入0.4%的台盼蓝溶液，各组细胞在0.5 h、1 h、2 h等时相点行细胞染色，各时相点染色五次，记录死亡细胞数；取出两组部分细胞按2×104活NSCs/ml密度加入96孔酶标板内，滴加100 μl，各时相点滴加五个孔，每个孔内滴加10 μl CCK-8溶液充分混匀，置于37℃、5% CO2培养箱中培养4 h，打开酶标仪器，选择450 nm波长和630 nm参比波长，记录两组光密度值(optical density，OD)。两组若在NSCs形态改变、台盼蓝死亡细胞计数、CCK-8检测细胞活性，以上三点中存在差异，则表明缺氧NSCs模型制作成功。

4.统计学处理：应用SPSS13.0统计软件进行分析，所有数据均以

表示,两组间比较用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.NSCs细胞的形态：经Nestin抗体鉴定该细胞为NSCs，见图2。缺氧前NSCs细胞形态规则，遮光性较强，边界较清楚，缺氧后细胞形态不规则，数量明显减少，缺氧时间的延长，细胞出现破裂，皱缩，见图3、图4。复氧复糖72 h后细胞形态不规则，数量减少，可见大小不等的克隆神经球，见图5。

2.各缺氧时相点台盼蓝NSCs计数：缺氧30 min NSCs死亡细胞数量(2.000±0.707)与对照组(2.200 ±0.837)比较，差异无统计学意义；缺氧1 h NSCs死亡细胞数量(9.200±2.387)与对照组(2.600 ±0.548)比较，差异具有统计学意义；缺氧2 h NSCs死亡细胞数量(21.000±1.581)与对照组(1.800 ±0.447)比较，差异有统计学意义；缺氧时间越长，死亡细胞数越多。

3.各缺氧时相点CCK-8法检测NSCs活性：缺氧30 minNSCs活性与对照组比较，差异无统计学意义；缺氧1 h、2 h NSCs的活性与对照组比较，差异均有统计学意义；缺氧1 h、2 h组与其他各组比较，差异均有统计学意义。见表1。

表1NSCs细胞活性比较

4.各复氧复糖时相点CCK-8法检测NSCs活性：复氧复糖24 h缺氧组OD值(0.409±0.002)与对照组(0.486±0.002)比较，差异具有统计学意义；复氧复糖72 h缺氧组OD值(0.483±0.003)与对照组(0.511±0.002)比较，差异具有统计学意义。

讨论

目前，国内外建立了多种细胞缺氧方法，化学性缺氧包括碱性焦性没食子酸溶液、厌氧产气袋等，碱性焦性没食子酸溶液法的优点是不与培养基接触、同时清除培养盒及培养基中的氧，缺点是废液可对水体环境产生污染、配制碱性液体时氢氧化钠可对操作人员、物品等造成危害[3]。厌氧产气袋法优点是不会产生压差和高温、废弃物处理方便、无污染，但存在缺氧时间长、费用高的缺点[4]。化学方法设备简单，制备迅速，但化学药物不可避免会对细胞产生损伤，且与真实缺氧有一定差异[5]。物理性缺氧是将培养的细胞置于充有N2和C02混合气体的低氧环境中培养。三气培养箱具有精确控制培养环境中O2及CO2浓度、波动幅度极小、稳定性高等优点，但具有成本高、缺氧时间长、占据一定空间等缺点[5]。

建立细胞缺氧模型的关键是控制作用时间、氧浓度，时间短、浓度低则达不到建模效果，时间长、浓度高则导致细胞死亡。低氧和缺氧对NSCs增殖及分化有不同的影响，NSCs处于相对低氧(氧浓度1%～8%)环境，3%～5%氧气浓度能够促进NSCs增殖和分化；缺氧(氧浓度<l%)则对NSCs造成损伤，甚至引起NSCs 凋亡[3,6]，本研究经过多次重复实验证实当氧浓度<l%时，缺氧NSCs形态学变化与三气培养箱缺氧NSCs形态学变化相同[5]，也证实缺氧时间越长，NSCs死亡数越多、活性越低。不同的缺氧装置建立NSCs缺氧细胞模型所需时间差异较大[7]，当氧气浓度<1%时，缺氧时间在6 h到数天不等[8-9]；当氧气浓度3%时，缺氧时间更长[10]，这种显著的差异，使所得的实验结果缺乏可比性，且缺氧时间长。

本研究设置3个缺氧时相点，采用CCK-8法及台盼蓝染色法检测细胞活性及死亡细胞数，当缺氧30 min时，NSCs死亡细胞数及活性与对照组比较均无明显变化；当缺氧时间达到1 h、2 h，NSCs死亡细胞数及活性与对照组比较，差异具有统计学意义；故认为缺氧1 h为建立NSCs细胞缺氧模型的最佳时间点，这样既节省了实验时间又达到了实验目的。

谭盛等[5]实验结果表明缺氧2 h可促进NSCs增殖且存活率有一定增长，而本实验缺氧2 h NSCs死亡细胞数增多且活性明显降低；出现此相反结果的原因可能是：(1)本装置内氧浓度更低，能在短时间内达到缺氧效果；(2)DMEM无糖培养基类似于活体发生低张性和循环性缺氧，而无糖Earle，S平衡盐溶液适合与NSCs增殖；(3)成年大鼠海马NSCs与生后1天大鼠NSCs生理状况存在差异。本装置采用真空棒抽气法清除装置内的氧，这与谭盛等[5]除氧法相比，本方法明显缩短清除氧气的时间。

本实验装置及方法具有经济、实用易操作、实验时间短、占据空间小、清洗方便、可重复使用、氧气清除率高、稳定性及安全性高等优点，所以该方法经济实用易操作、仪器简单、效率及成功率高。

1 Yin XJ,Li H,Zhang XY,et al.Development of neural stem cells at different sites of fetus brain of different gestational age.Int J Clin Exp Pathol,2013,6:2757-2764.

2 王钰,尹晓娟.锂对缺氧状态下新生鼠神经干细胞损伤的影响.中国儿童保健杂志,2013,21:1045-1048.

3 韩宁,殷安安,章翔,等.缺氧盒在神经干细胞氧糖剥夺培养中的应用.中华神经外科疾病研究杂志,2013,12:5-7.

4 Katoh C,Osanai T,Tomita H,et al.Brain natriuretic peptide is released from human astrocytoma cell line U373MG under hypoxia:a possible role in anti-apoptosis.J Endoerinol,2011,208:51-57．

5 谭盛,陈健,郭阳,等.大鼠成年海马神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型的建立.中华神经医学杂志,2011,10:1238-1242.

6 Binh NH,Aoki H,Takamatsu M,et al.Time-sensitive effects of hypoxia on differentiation of neural stem cells derived from mouse embryonic stem cells in vitro.Neurol Res,2014,36:804-813.

7 Liu Q,Fan X,Zhu J,et al.Co-culturing improves the OGD-injured neuron repairing and NSCs differentiation via Notch pathway activation．Neurosci Lett,2014,559:1-6.

8 Yao L,Chen X,Tian Y,et al.Selection of housekeeping genes for normalization of RT-PCR in hypoxic neural stem cells of rat in vitro.Mol Biol Rep,2012,39:569-576.

9 Park J,Park HH,Choi H,et al.Coenzyme Q10 protects neural stem cells against hypoxia by enhancing survival signals.Brain Res,2012,1478:64-73.

10 Liu SP,Fu RH,Wu DC,et al.Mouse-induced pluripotent stem cells generated under hypoxic conditions in the absence of viral infection and oncogenic factors and used for ischemic stroke therapy.Stem Cells Dev,2014,15,23:421-433.

作者单位:214002 江苏,无锡市妇幼保健院新生儿科(陈长春,周勤)；100700 北京,中国人民解放军陆军总医院附属八一儿童医院新生儿科(尹晓娟)