方式表达；组间精子活力比较采用 t 检验， P <0.05视为差异有统计学意义。 ·实验研究·
李安娜 张美华 房振亚 邱毅
【 摘要 】 目的 通过对低渗肿胀实验(HOST)、苯胺蓝(AB)染色实验、染色质扩散(SCD)实验、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)实验、AB/HOST实验，SCD/HOST实验、HOST/TUNEL实验的检测结果中精子活性分级进行比较，探索优化精子活性的检验方法。 方法 选取2012年5月—2016年10月已育成年健康男性志愿者30例。每例样本分为7组，分别为：HOST组、AB组、SCD组、TUNEL组、HOST/AB组和HOST/SCD组、HOST/TUNEL组。分别进行相应方法的染色，观察精子尾部肿胀及核蛋白、DNA受损情况，计算各级活力精子的比例。 结果 单独AB和单独HOST与HOST/AB比较，精子分级差异有统计学意义；单独SCD和单独HOST与HOST/SCD比较，精子分级差异有统计学意义；单独TUNEL和单独HOST与HOST/TUNEL比较，精子分级差异有统计学意义。 结论 HOST/AB联合染色及HOST/SCD联合染色是对精子的核蛋白、DNA及膜完整性判断更为准确和实用的方法。
【 关键词 】 精子； 苯胺蓝染色； 低渗肿胀实验； 染色质扩散实验； 核蛋白； TUNEL
精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关，测定精子膜是否完整可以准确地反映精子功能并预测精子潜在受精能力。通过精子尾部低渗肿胀实验(hypoosmotic swellingtest,HOST)测定人精子膜功能始创于1984年，是目前为数不多的评价精子膜功能的检测方法之一，越来越广泛地被应用于男性生殖避孕和不育的基础研究和临床诊治中 [1-4] 。细胞的物质交换和新陈代谢活动依靠细胞膜进行，精子在男、女性生殖道中极易受到各种化学物质影响，精子膜对这些物质的传递能力直接影响精子的活力和新陈代谢，从而关系到能否获能，完成受精的全过程。因此，评价精子膜功能在精子功能检测中具有重要意义。但是，单纯的精子低渗肿胀实验只能检测精子细胞膜是否完整，而不能检测出核蛋白是否受损，不能准确地判断精子的活性 [5,6] 。精子DNA完整性对自然受孕、人工授精、胚胎、胎儿、婴儿甚至成人的发育至关重要 [7,8] 。研究表明精子DNA完整性是优于常规精液分析的独立参数 [5,6] ，与辅助生殖技术结局有相关性 [7] ,已经有多种方法如精子苯胺蓝(aniline blue,AB)染色、精子染色质扩散(sperm chromatin dispersion,SCD)实验及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)检测精子染色质和DNA的完整性，但这些检测的结果与流产或其他怀孕结果之间是否有关尚不清楚 [1] 。因此，对男性不育患者进行精子DNA完整性分析，有助于探讨或发现其不育的原因，为患者的预防和治疗提供咨询及诊断依据。但现有的检测方法难以同时准确判断出同一条精子的细胞膜及核蛋白是否受损，即难以对精子的质量作出精确的评价。
本文将精子低渗肿胀实验分别与AB染色核蛋白检测、SCD实验及TUNEL联合使用与各检验方法单独使用相比较，目的是验证同时检测精子核蛋白及膜完整性是否可以更准确地判断精子质量，从而改进精子质量的检测方法。
选取2012年5月—2016年10月就诊已育成年健康男性志愿者30例。临床试验入选标准为无心血管系统、呼吸系统、泌尿系统及神经系统疾病，无传染病史，需采取避孕措施节育，身体健康、已婚且至少生育有1个子女的男性(32～48岁，有二胎生育指标)，填写知情同意书。本临床试验经山东省计划生育科学技术研究所医学伦理委员会批准。
1.精液常规分析：按照WHO《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》 [9] 精液变量参考值的标准：液化时间少于60 min，精液量>2 ml，浓度大于20×10 6 /ml，存活率≥60%，前向运动精子≥50%，精子正常形态率>30%，为正常精液指标参数。连续3次精液常规检查5×10 6 /ml≤精子密度<20×10 6 /ml为少精子症，精子密度<5×10 6 /ml为严重少精子症。
2.试剂制备：
(1)低渗液：100 ml超纯水中加入0.735 g柠檬酸钠和1.35 g果糖，检测离子强度为0.15(系数)，渗透压为150 mOsm(摩斯摩尔)。
(2)伊红-吉姆萨染液：100ml生理盐水中加入0.5 g伊红(E6003,美国Sigma公司)和0.1g吉姆萨(G4507,美国Sigma公司)混匀配置成0.5%的染液，双层滤纸过滤，所得滤液即伊红-吉姆萨染液，室温保存备用。
3.精子低渗肿胀实验(HOST)：向1 ml低渗液中加入0.1 ml精液，混匀,37℃水浴30 min，使用显微镜观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率。
4.苯胺蓝染色(AB染色)与染色质扩散(SCD)实验 [5，8] 及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)实验按照常规方法进行 [10-12] 。
5.HOST结合精子苯胺蓝染色(HOST/AB)：取1 ml低渗处理(HOST)后的精液，1000 rpm离心5 min，弃上清，所得精子沉渣用PBS稀释到10×10 6 /ml；取0.1 ml上述精子悬液与0.1 ml PBS充分混匀，1000 rpm离心3min，弃上清，精子沉淀物加0.1 ml PBS洗涤3次后加0.1 ml明胶，吸取20 μl置入载玻片上，空气中自然干燥；载玻片在室温条件下加甲醇固定90 s；加入0.4 mol/L的苯胺蓝染色5 min；自来水缓慢冲洗，然后将载玻片浸入生理盐水中脱色19 min；自然晾干或吹干后加甘油封固液2滴，盖玻片封片。普通光学显微镜下观察200个精子。
6.HOST结合精子染色质扩散实验(HOST/SCD)：取1 ml低渗处理(HOST)后的精液，1000 rpm离心5 min，弃上清，精子沉渣用PBS稀释到10×10 6 /ml，取0.2 ml精液与琼脂凝胶按1：1比例混匀，37℃孵育；吸取50 μl上述精液置于琼脂包被的载玻片上，盖盖玻片4℃放置4 min；去除盖玻片，放入0.08 N的HCl内室温孵育7 min后加入0.4 M Tris，0.8M DTT，1% SDAS，室温孵育5 min；标本片放入0.09 M的Tris和0.002 M的EDTA冲洗2 min；经70%、90%和100%乙醇梯度脱水；空气中自然干燥后加入DAPI染色，荧光显微镜下观察结果。加入瑞-吉氏染液后显微镜下观察精子。
7.HOST结合脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)实验：取1 ml低渗处理(HOST)后的精液，1000 rpm离心5 min，弃上清，精子沉渣用PBS稀释到10×10 6 /ml，取0.2ml精液与琼脂凝胶按1∶1比例混匀，37℃孵育5 min；吸取50 μl上述精液置于琼脂包被的载玻片上，盖盖玻片4℃放置4 min；去除盖玻片，置于4%多聚甲醛中固定25 min，PBS清洗；置于0.2% Triton X-100中5 min，PBS清洗；将50 μl TdT和450 μl荧光素标记的dUTP液混匀制备混合液；载玻片加50～100 μl二氨基联苯胺(DAB)底物,15～25 ℃孵育10 min；苏木素或甲基绿复染，自来水冲洗；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；显微镜下观察结果。
8.统计学分析：采用SPSS 11.5进行统计处理，精液常规分析数据、HOST、AB、SCD、TUNEL实验的精子比率(%)以 方式表达；组间精子活力比较采用 t 检验， P <0.05视为差异有统计学意义。
精子在低渗溶液里进行肿胀实验后，接着进行精子苯胺蓝染色核蛋白检测，得到的精子形态变化及核蛋白改变共有4种类型(AB1-AB4)，见表1及图1。其中：AB1型精子是精子膜与核蛋白均完整的，精子头部未被苯胺蓝染色且尾部肿胀，是正常的精子；AB2型精子是核蛋白完整而精子尾部膜受损，精子头部未被苯胺蓝染色而尾部未肿胀；AB3型精子是精子核蛋白受损而尾部膜未受损，精子头部被苯胺蓝染色而尾部肿胀；AB4型精子是精子核蛋白受损且尾部也受损，精子头部被苯胺蓝染色且尾部未肿胀。单独AB和单独HOST实验统计数据与HOST/AB联合法相比，AB1型与AB4型差异有统计学意义( P <0.001)；单独AB和单独HOST实验正常精子比较差异无统计学意义( P =0.410)。
表1 单纯精子低渗HOST、单纯精子AB核蛋白检测及HOST/AB联合实验正常生育男性检测结果比较
Table 1 Comparison of testing results of normal fertility males with HOST,AB and HOST/AB combined experiment
* P <0.001，compared to HOST/AB.
图1 (a)HOST/AB结合实验正常AB1型精子图像，头部未被苯胺蓝染色且尾部肿胀，精子膜与核蛋白均完整的，是活动的正常精子；(b)AB2型精子，核蛋白完整而精子尾部膜受损，精子头部未被苯胺蓝染色而尾部未肿胀，这种精子是有活动能力的精子；(c)AB3型精子，精子核蛋白受损而尾部膜未受损，精子头部被苯胺蓝染色而尾部肿胀，在单纯精子低渗肿胀实验里被判断为活动的精子，因为精子尾膜是肿胀的，即完整的；(d)AB4型精子，精子核蛋白受损且尾部也受损，精子头部被苯胺蓝染色且尾部未肿胀，是死精子；(e)HOS/AB结合实验结果，可见尾部肿胀头部被苯胺蓝染色的精子；(f)单纯HOS实验精子图像。
Figure 1 (a) Type AB1 sperm of HOST/AB experiment:Its head was not stained with aniline blue and tail was swollen.the sperm membrane and nuclear protein were intact.It was active normal sperm; (b) Type AB2 sperm:Its nucleoprotein was intact and tail membrane was damaged.The sperm head was not stained with aniline blue and the tail was not swollen.This sperm was movable; (c) Type AB3 sperm:Its nucleoprotein was damaged and the tail membrane was not affected.Its head is stained with aniline blue and the tail was swollen.It was judged to be active sperm in HOST,because the sperm tail membrane was swollen that it was intact; (d) Type AB4 sperm:Its nucleoprotein was damaged and tail was intact.the sperm head was stained with aniline blue and the tail was not swollen,it was dead sperm; (e) The sperm with swollen tail and blue head in HOS/AB binding experiment; (f) The sperm image in HOS experiment.
计数500个精子，观察精子光晕大小及尾部肿胀情况，分为4个等级(A-D)，见表2及图2。A型：尾肿胀(HOS+)而具有大光晕或中光晕 (SCD+)的精子，判断为尾膜及DNA均完整的精子，(SCD+)-(HOS+)。B型：尾不肿胀(HOS-)而具有大光晕或中光晕 (SCD+)的精子，判断为尾膜损伤而DNA完整的精子，(SCD+)-(HOS-)。C型：尾肿胀(HOS+)而具有小光晕或无光晕的精子，判断为尾膜完整而DNA损伤的精子，(SCD-)-(HOS+)。D型：尾不肿胀(HOS-)而具有小光晕或无光晕的精子，判断为尾膜及DNA均损伤的精子，(SCD-)-(HOS-)。单独SCD和单独HOST实验与HOST/SCD实验相比，A型和D型精子比较差异均有统计学意义( P <0.01)；单独SCD和单独HOST实验中正常精子比较差异无统计学意义( P =0.127)。
表2 应用单纯HOS、单纯SCD及HOST/SCD结合实验30例正常生育男性检测结果比较
Table 2 Comparison of testing results of 30 normal males with HOS、SCD and HOST/SCD
* P <0.01，compared to HOST/SCD.
图2 (a) 单纯SCD实验显示大光晕及中光晕精子(SCD+)；(b) HOS/SCD结合实验,1为小光晕而尾部不肿胀的精子(D型精子)，2为无光晕的精子，3、4和5为具有大光晕且尾部肿胀的精子，(SCD+)--(HOS+)；(c)具有大光晕且尾部肿胀的精子；(d)具有大光晕而尾部未肿胀的精子；(e) 具有中光晕且尾部肿胀的精子；(f)具有中光晕而尾部未肿胀的精子；(g) 具有小光晕且尾部肿胀的精子；(h) 具有小光晕而尾部未肿胀的精子；(i) 无光晕而尾部肿胀的精子；(j) 无光晕且尾部未肿胀的精子；(k) 尾部肿胀的双头精子；(l) 尾部未肿胀的针尖头样精子；(m)无光晕而尾部肿胀的退化的精子；(n)无光晕且尾部未肿胀的精子。
Figure 2 (a) SCD experiments show large and medium halo sperm (SCD+); (b) HOS/SCD binding experiments:1 was a sperm with small halo and tail not swollen (D-type sperm); 2 was a sperm without halo; 3,4 and 5 were sperms with large halo and tail swelling,(SCD+)--(HOS+).(c) Sperm with large halo and swollen tail; (d) Sperm with large halo and tail not swollen; (e)Sperm with medium halo and swollen tail; (f) Sperm with medium halo and tail not swollen; (g)Sperm with small halo and swollen tail; (h)Sperm with small halo and tail not swollen; (i) Sperm without halo and with swollen tail; (j)Sperm without halo and swollen tail; (k) Bouble-headed sperm with swollen tail; (l) Needle-like sperm without swollen tail; (m) Degraded sperm without halo and with swollen tail; (n) Sperm without halo swollen tail.
HOST、TUNEL及HOST/TUNEL结合实验共测定30例正常生育男性，HOST/TUNEL结合实验得得到的精子形态变化及凋亡共有4种类型(A-D)见表3与图3，其中A型精子尾部肿胀、精子头部染蓝色，即精子膜与染色质均完整而未发生凋亡的，精子是具有活动能力或是活的；B型精子头部染蓝色而尾部未肿胀，即精子染色质完整、未凋亡而尾部膜损伤，是有活动能力的精子；C型精子头部染红色或紫色而尾部肿胀，是凋亡精子；D型精子头部染红色或紫色而尾部也不肿胀，是凋亡和尾部膜损坏的精子。单独TUNEL和单独HOST实验与HOST/TUNEL实验相比，A型和D型精子比较差异均有统计学意义( P <0.01)。
表3 应用单纯HOST、TUNEL及HOST/TUNEL结合实验30例正常生育男性检测结果比较
Table 3 Comparison of testing results of 30 normal males with HOS、TUNEL and HOST/TUNEL
* P <0.01，compared to HOST/TUNEL.
图3 (a)单纯TUNEL实验。1为头部染蓝色后显示为绿色的正常精子；2为头部染蓝色后显示为紫色的凋亡精子图像，没有经过HOST实验，尾部没有肿胀；(b)HOST/TUNEL结合实验。1为A型精子，即头部染成绿色而尾部肿胀的精子，2为B型精子，即头部染成绿色而未尾部肿胀的精子；(c)HOST/EUNEL结合实验：A型；(d)为B型；(e)为C型；(f)为D型。
Figure 3 (a)TUNEL experiment:1 was normal sperm with green head after staining blue; 2 was apoptotic sperm with purple head after staining blue,whose tail was not swollen without HOST; (b) HOST/TUNEL experiment:1 was a type A sperm,that the head was green and the tail was swollen; 2 was a type B sperm,that the head was green and the tail was not swollen; (c) HOST/TUNEL experiment： Type A; (d) Type B; (e) Type C; (f) Type D.
在人类精子成熟过程中，DNA极易受内外环境因素影响而形成DNA碎片，从而引起精子形态和功能异常，导致男性不育，并带来遗传风险。尽管精子DNA完整性一直是生殖医学领域研究热点，但过去对精子DNA完整性的研究并不多，主要原因是方法学不足。随着技术的改进和研究的深入，精子DNA完整性检测方法逐渐增多。但应用精子膜完整性与DNA完整性检测同一条精子的结合方法尚少见报道。
在HOST和HOST/AB实验的对比中，AB1(HOS+)和 AB4(HOS-)型精子分别对应活动且头膜-尾膜完整的精子和死亡精子。但对AB2型精子，单纯HOST实验会判断其为没有活动能力的死精子，但实际上这种精子是活精子，只是精子尾部膜受到损伤；而对AB3型精子，单纯HOST实验则判断其为活精子，但实际上这种精子是死精子。其中AB2型和AB3型精子(5.1%～5.7%)在单独HOST及单独AB实验中判断的结果是相反的，而HOST/AB两种方法结合判断为异常精子，所以，应用HOST/AB结合实验才能对这些精子做出正确判断。
在HOST和HOST/SCD实验的对比中,A(HOS+)型精子和D(HOS-)型精子分别对应活动且精子尾部膜-DNA均完整的精子和精子DNA及膜均损伤的死亡精子。但对B型精子，单独使用HOST实验只能判断其为死精子，但实际上这种精子是活精子，只是精子尾部膜受到损伤；而对C型精子，单纯HOST则判断其为活精子，实际上这种精子是死精子，应用HOST/SCD检测结合实验，才能对这些精子做出正确判断。本研究在改良的SCD实验 [6] 基础上，进一步缩短了操作时间，并改瑞氏染液为瑞氏-姬姆萨染液，在普通光学显微镜下可清晰观察到精子晕环，方法稳定、简单，重复性好，可直观定量显示精子DNA完整性水平，使之更适用于临床检测。HOST/SCD观察到4个等级(A-D)精子，其中B型和C型精子(5.8%～5.9%)在单独HOST及单独SCD实验中判断的结果是相反的，而HOST/SCD两种方法结合判断为异常精子，增加了异常精子的检出比例。
TUNEL法是检测细胞凋亡过程中细胞核DNA 完整性的有效方法，广泛应用于男性不孕症研究中 [14] 。有研究比较了TUNEL 法、SCSA 法和SCGE 法三种检测方法，认为TUNEL 法能更好的检测出精子DNA 单链及双链的断裂情况 [15] 。在HOST和HOST/TUNEL实验的对比中,我们的实验结果证实了单纯精子HOST实验对于判断精子活动能力和膜的完整性是不完全的，单纯TUNEL实验判断精子是否正常也是不完全的。对于A型精子和D型精子，单纯HOST实验和本发明所述方法的实验判断结果是一致的，即A型精子是活动的和头膜-尾膜完整的精子，D型精子是DNA和膜均损伤的精子(凋亡)，是死亡的精子，但对B型精子，单只能判断其为死精子，实际上这种精子是活精子，而对C型精子则判断为活精子，实际上这种精子是死精子。将HOST和TUNEL结合在同一条精子上进行，使单独HOST及单独TUNEL试验检测部分为正常的精子确定为异常精子，因为两种方法都存在一定缺陷，如HOST试验只能检测精子膜的完整性，而不能测定精子的DNA完整性及凋亡情况，TUNEL试验只能测定精子的DNA完整性及凋亡情况，而不能检测精子膜的完整性。因此，建立TUNEL/HOST结合实验很有必要。
我们的实验结果证实了单纯HOST实验对于判断精子活动能力和膜的完整性是不完全的。单纯的AB、SCD及TUNEL实验只能判断核蛋白或DNA的完整性而不能对精子的膜完整性进行正确判断。因此，这三种联合实验对精子的核蛋白、DNA及膜完整性的判断是较为准确和实用的。
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LI Anna , ZHANG Meihua , FANG Zhenya , QIU Yi .
Key Laboratory of Fertility Regulation and Control Technology of National Health and Family Planning Commission ; Shandong Provincial Maternal and Child Health Hospital ; Shandong Provincial Family Planning Institute of Science and Technology , Jinan 250002, China
[ Abstract ] Objective Compare the sperm motility classification of hypoxia (HOST),aniline blue (AB) staining,chromatin diffusion (SCD),the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay,HOST/AB,HOST/ SCD and HOST/ TUNEL test,to optimize testing method of sperm motility. Methods 30 healthy male volunteers were enrolled from May 2012 to October 2016. Each sample was divided into seven groups:HOST group,AB group,SCD group,TUNEL group,HOST/AB group,HOST/SCD group and HOST/TUNEL group. Respectively,after stainedin the corresponding method,observe the tail swelling,nuclear protein and DNA damage of the sperm,calculated theproportion of viable spermatozoa at all levels. Results There was significant difference of the classification of sperm between HOST,AB alone and HOST/AB test ( P <0.01).There was significant difference of the classification of sperm between HOST,SCD alone and HOST/SCD test ( P <0.01). There was significant difference of the classification of sperm between HOST,TUNEL alone and HOST/TUNEL test ( P <0.01). Conclusion HOST/AB,HOST/SCD and HOST/TUNEL test are more accurate and practical methods for judging the nucleoprotein,DNA and membrane integrity of sperms.
[ Key words ] sperm; aniline blue staining; hypotonic swelling test; chromatin diffusion test; nucleoprotein; TUNEL
通讯作者： 邱毅(qiuyi987@sina.com)
基金项目： 山东省科技发展计划(2015GSF118072)
作者单位：250014 济南,国家卫生和计划生育委员会生育调控技术重点实验室，山东省妇幼保健院，山东省计划生育科学技术研究所，山东省立医院集团妇产医院
(收稿日期： 2017-09-11)