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许展 程东凯 刘双 赵雨杰
【 摘要 】 目的 探讨体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)新鲜周期移植完全来源未见原核(non-pronuclear,0PN)(可见2极体)胚胎的临床结局。 方法 回顾性分析2012年5月—2016年3月在本中心接受IVF-ET治疗(包括常规IVF和ICSI)，移植完全来源0PN(可见2极体)胚胎的妇女共145例，分析其临床结局。 结果 145例妇女在新鲜移植周期共移植来源0PN(可见2极体)胚胎198枚，胚胎着床率17.7%(35/198)。临床妊娠28例，临床妊娠率19.3%(28/145)，其中22例孕妇分娩活产健康子代23例(含1例双胎妊娠)，未见畸形，1例异位妊娠，2例胎停育、1例无胎心、1例感染引产、1例流血流产。 结论 IVF周期中，无2PN胚胎但可见2极体胚胎的情况下，在充分告之病人知情同意后，可行移植0PN，并需对临床妊娠过程及结局严密观察追踪。
【 关键词 】 未见原核； 卵裂期胚胎； 妊娠率； 着床率
作者单位：110122 沈阳，中国医科大学生物信息教研室(赵雨杰)；110005，沈阳东方菁华医院(许展，程东凯，刘双)
体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)过程中，正常受精是指卵子于授精后16～20 h呈现2个清晰的原核(pronuclei,PN)，同时有2个极体(polar body,Pb) [1] 。IVF-ET周期中优先选择来源于2PN的胚胎进行移植，但有很多周期中含有未见原核(0PN)的胚胎。有文献报道，在IVF-ET周期中，约有30%～40%的卵子在镜下观察表现为未见原核，这部分胚胎能否用于移植、如何选择尚存在争议 [2] 。也有报道显示，如果在没有正常可利用胚胎的情况下移植0PN(可见2极体)来源胚胎可生育健康子代 [3] 。本文通过在本生殖中心接受完全来源0PN(可见2极体)的卵裂期胚胎新鲜移植周期的病例进行回顾性分析，患者的妊娠情况，以期了解0PN(可见2极体)卵裂期胚胎的临床应用价值。
1.对象：选择2012年5月—2016年3月在本中心接受IVF-ET治疗(包括常规IVF和常规ICSI)的患者中，新鲜移植周期移植完全来源0PN但可见2极体胚胎的145例妇女。
2.方法
(1)促排卵方案：促排卵采用常规长方案、短方案或拮抗剂方案。B超监测卵泡发育情况，当出现1～2个主导卵泡直径≥18 mm时注射绒毛膜促性腺激素(HCG)(珠海丽珠医药集团股份有限公司)5 000～10 000 IU后约36～38 h在B超引导下经阴道取卵。
(2)精液的准备：患者丈夫取卵日上午手淫取精。采用密度梯度离心后上游法处理精液标本，将吸出的液体置于CO 2 培养箱中备用。
(3)体外受精-胚胎培养：IVF授精为取卵后2～4 h。精子的授精浓度为(5～10)×10 5 ml。精卵共同培养4～5 h后，脱颗粒细胞，将卵母细胞转移到新的培养皿培养。ICSI是取卵后2h受精后16～20 h观察原核的形成，第2天(D2)第3天(D3)观察胚胎发育情况。
(4)授精评估：授精后16～19 h观察原核。2PN是正常受精，判断标准：可见2个原核且可见极体。0PN判断为可见2个极体未见原核。0PN 2极体判断为2个极体之间有可辨的距离。1PN判断为可见极体和仅见1个原核。根据授精情况不同分组培养。145例妇女均是受精卵D1未见2PN胚胎，D3观察到0PN卵裂来源的胚胎，在患者知情同意后，移植0PN来源的胚胎。
(5)胚胎评分及移植：我中心D3卵裂期胚胎评分标准为Ⅰ级：卵裂球等大均匀，无核碎片≤10%，胞浆饱满，质地均匀；Ⅱ级：卵裂球大小轻度不一致、不对称，无核碎片10%～20%，胞浆饱满，质地均匀度稍差；Ⅲ级：卵裂球大小不一致，不对称，无核碎片20%～50%，胞浆浓缩，质地粗糙；Ⅳ级：卵裂球大小形如碎片不一致，不对称，无核碎片≥50%，胞浆颗粒不均匀；其中Ⅰ～Ⅲ级为可利用胚胎予以移植，移植分裂期胚胎1～2枚。优胚：本实验室将取卵后第三天，正常受精且发育速度正常的胚胎发育至6～8个细胞，卵裂球大小均一、碎片无或小于20%，这些胚胎定义为优质胚胎，其他胚胎(如发育速度过慢，碎片过多)均定义为非优质胚胎。
(6)观察指标及定义：D3胚胎移植后14 d测尿和血清hCG，若阳性定义为生化妊娠；于移植29 d后行B超检测，以宫腔内可见孕囊及胎心定义为临床妊娠。定期随访，记录出生婴儿健康情况。
3.统计学处理：应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料采用频数(%)表示，计量资料采用 表示。
145例患者的年龄为22～49岁，平均(37.7±5.4)岁。完全来源0PN(可见2极体)的卵裂期胚胎新鲜移植周期中IVF 123个周期，ICSI 22个周期，共获得卵子546枚，平均获卵(3.8±4.3)枚，成熟卵子数411枚，D1天0PN卵子/胚胎280枚，D2天0PN卵裂胚胎245枚，卵裂率为87.5%(245/280)，优胚139枚，优胚率为56.7%，共移植198枚胚胎，周期平均移植数1.37个，D3胚胎着床率为17.7%(35/198)。
临床妊娠28例，胎停2例、无胎心1例、异位妊娠1例、感染引产1例、流血流产1例，22例孕妇活产分娩：23例活产婴儿(1例双胎，为1男1女，其余单胎分别为13男，8女)体检均未见异常，临床妊娠率为19.3%(28/145)。
在辅助生殖技术助孕过程中，一般选择2PN来源的胚胎进行移植，并认为此类胚胎为形态发育正常的胚胎。但有部分卵子在D1观察判断受精时未见到原核，但D2天又发生卵裂，甚至一部分能发育成形态正常的胚胎 [4] 。一般认为，此类胚胎不适合进行移植。但有研究表明，0PN(可见2极体)中也存在正常受精的胚胎，这些胚胎染色体正常 [5] 。
0PN的形成机制可能有以下几个方面：①未受精；②由于原核形成延迟，原核尚未出现或由于原核提前融合而过早消失以至在授精后16～20 h 显微镜下无法观察到原核 [6-7] 。0PN胚胎可能出现如下情况：①正常受精；②正常受精但存在非整倍体异常 [8] ；③未受精：孤雌激活，指处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞不经过精子受精，而在某些理化因素的刺激下恢复并完成第二次减数分裂，发生卵裂形成早期胚胎；二倍体双雌胚胎，表现为未见原核及单个极体(1PB)，其形成机制可能是未分裂出来的第二极体参与到核遗传物质的形成 [9] ；④各种异常受精：多精受精、精子染色体解聚异常、雌性原核形成异常等 [10] 。由此可见，0PN胚胎中有一部分是正常受精的胚胎 [11] 。有资料显示，IVF授精后观察为0PN的卵子中大约有20%可发育成正常的胚胎；还有文献报道，0PN胚胎的发生率是12.7%～20.0% [12] 。
本研究临床妊娠28例，22例活产，活产出生者体检均未见异常。流产病例没有对绒毛进行染色体检测，无法判断移植的胚胎本身是否正常。以上结果表明，0PN(可见2极体)来源的卵裂期胚胎进行移植可获得正常妊娠结局。因此，如果没有正常受精(2PN)胚胎移植时，可考虑移植来源0PN(可见2极体)的胚胎，但如何选择正常的胚胎进行移植需要进一步研究和探讨；选择来源0PN的正常胚胎，我们可以注意以下几点：①对来源0PN的胚胎，注意选择2个极体的胚胎；②尽可能将来源0PN的胚胎培养至囊胚，从而使胚胎得到进一步的自然筛选 [13] ；③尽量在授精后16～20 h之间观察原核；④可以选择时差(Time-lapse)摄像系统连续观察胚胎，以避免因局限某一时间观察胚胎而致 PN 数的误判 [14] ；⑤也可将来源 0PN的胚胎进行 PGS检测后再行移植 [15] 。
综上所述，无2PN胚胎的情况下，在充分告之病人知情后可行移植0PN但可见2极体胚胎，并需对临床妊娠过程及结局严密观察追踪。
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通讯作者： 赵雨杰(yjzhao@cmu.edu.cn)
(收稿日期： 2017-09-05)