HPV E6/E7mRNA在宫颈病变检测中的诊断价值

【摘要】目的探索HPV E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值。方法收集2016年12月—2017年5月在西京医院妇科行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查发现疑似宫颈病变并转阴道镜行组织活检的女性163例，活检同期均行HPV E6/E7mRNA检测，以宫颈组织病理活检结果为标准对照。比较HPV E6/E7mRNA、细胞学、HPV DNA分型三种方法检测CIN II+的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征曲线下面积(AUC)等指标，及三种方法对各宫颈病变的检出能力，并分析HPV E6/E7mRNA表达水平与病变关系。结果HPV E6/E7mRNA、HPV DNA基因分型和细胞学检测病变CIN II+的灵敏度分别为86.8%、88.7%、88.7%；特异度为71.8%、19.1%、43.6%；阳性预测值为59.7%、34.6%、43.1%；阴性预测值为91.8%、77.8%、88.8%；阳性似然比为3.1、1.1、1.6；阴性似然比为0.2、0.6、0.3；AUC为0.793、0.539、0.662，HPV E6/E7mRNA诊断准确性优于细胞学和HPV DNA分型；不同病理级别中HPV E6/E7mRNA表达水平差异具有统计学意义(P<0.01)，且HPV E6/E7mRNA表达水平与宫颈病变级别呈正相关(P<0.05)。结论HPV E6/E7mRNA检测对宫颈病变的诊断具有一定的临床指导意义，临床医生应给予关注。

作者单位：710032 西安，空军军医大学西京医院妇产科(苏瑛，罗天爱，谢婷婷，于月成)；西北大学附属医院西安市第三医院妇产科(范小斌)

宫颈癌是危害女性健康的最常见恶性肿瘤之一。随着中国经济的快速发展，同时受职业和性观念日益开放的影响，妇女宫颈癌发病率呈上升且年轻化的趋势，每年新发病例约占全球发病数量的1/3，如何有效防控宫颈癌的发生、发展是整个社会面临的重要挑战。随着人乳头瘤病毒(human papillonmavirus，HPV)感染被确认为宫颈癌的主要病因[1]，有关HPV的检测技术如雨后春笋般兴起，细胞学不再是唯一的筛查选择。HPV DNA基因分型检测因敏感度高、操作简单在临床应用较为广泛，但由于其假阳性率高、特异度低，增加了患者不必要的阴道镜检查和焦虑。近年来，HPV E6/E7mRNA为一种新肿瘤标志物，是HPV感染后宫颈病变开始及进展的必要条件。研究证实，当HPV持续感染时，病毒基因与宿主染色体整合，E6/E7癌基因被激活，宿主细胞以E6/E7 DNA为模板转录生成E6/E7mRNA，E6/E7mRNA进一步翻译成E6/E7癌蛋白，癌蛋白与细胞周期调节蛋白(抑癌蛋白P53、RB等)结合，导致细胞周期调控失常引发癌变；当HPV一过性感染时，病毒DNA在细胞核内处于游离状态，E6/E7mRNA不表达或低表达，不能持续大量产生癌蛋白，可见E6/E7mRNA是HPV致病的必备中间环节[2-5]。国内外部分研究显示，HPV E6/E7mRNA在宫颈病变检测中表现出与HPV DNA基因分型一样的敏感度和更高的特异度[6-8]。本研究通过对比分析HPV E6/E7mRNA、 HPV DNA基因分型、细胞学在宫颈病变中的诊断价值，以期为宫颈病变检测方法的选择提供临床依据。

资料与方法

一、资料来源

收集2016年12月—2017年5月在本院行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查、发现疑似宫颈病变并转阴道镜下活检的女性患者163例，年龄 30～40岁，平均年龄(35.7±1.3)岁，均有性生活。纳入标准：细胞学≥ASCUS 或HPV DNA基因分型阳性者转阴道镜活检；活检同期行HPV E6/E7 mRNA检测。排除标准：既往患有宫颈癌前病变；因良性疾病切除子宫；妊娠期、哺乳期、近期有激素使用史。

二、方法

1.采集方法：取材时避开月经期，3 d内无阴道上药和冲洗，24 h内无性生活。使用专用采样器，将采样刷置于颈鳞柱状上皮交界处，沿顺时针方向旋转3～5圈，将采样刷折断置于标本保存液中，待专业人员检测。

2.液基细胞学检查方法：脱落细胞经ThinPrip2000系统处理制片、固定、染色后镜检。根据2001年修订的伯塞斯达诊断系统(the Bethesda system,TBS)进行阅片判读[9]。结果分为未见上皮内病变细胞(negative for intraepithelial lession or maglignany，NILM)，非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)，低度鳞状上皮内病变(Ligh grade squamous intraepithelial lessions，LSIL)，高度鳞状上皮内病变(High grade squamous intraepithelial lessions，HSIL)。细胞学结果≥ASCUS为阳性(+)，<ASCUS为阴性(-)。试剂盒和仪器来源于武汉呵尔医疗科技发展有限公司。

3.HPV E6/E7mRNA检测方法：采用杂交信号放大的核酸检测技术。宫颈细胞标本经过漂洗、裂解、缓冲、布板信号放大、QuantiVirus冷光仪检测等步骤，定量检测mRNA拷贝数，电脑分析处理数据并判读结果，结果用相关光单位(RLUs)表示，超过发光阈值(CO)为阳性。可检测14种高危型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)，不具体分型。QuantiVirusTM HPV E6/E7mRNA 试剂盒和仪器均来源于河南科蒂亚生物技术有限公司。

4.HPV DNA基因分型检测方法：脱落细胞行DNA提取、PCR扩增、PCR杂交后，用Luminex200行流式荧光杂交检测HPV型别，任何HPV型别特异性探针的信号大于150，即判断该探针对应的亚型阳性。该试剂可检测13种高危型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66)，4种可能高危型(68、26、53、82)，本研究不分析低危型别。试剂盒来源于上海透景生命科技股份有限公司。

5.阴道镜活检方法：由妇科医生操作，充分暴露宫颈，用4%醋酸溶液涂抹整个宫颈，全面观察后，继以碘液涂抹整个宫颈并充分观察，对呈现出白色病变、点状血管、碘不着色等异常表现部位行多点活检，送检。宫颈鳞状上皮癌前病变的组织病理诊断和描述采用世界卫生组织分类，即(1)轻度宫颈上皮内瘤变(grade1 cervical intraepithelial neoplasia，CIN I)；(2)中度宫颈上皮内瘤变(grade 2 cervical intraepithelial neoplasia，CIN II)；(3)重度宫颈上皮内瘤变(grade 3 cervical intraepithelial neoplasia；CIN III)；(4)宫颈鳞癌(squamous carcinoma of the cervix，SCC)。宫颈病理活检结果为金标准。

6.统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量数据用

表示，组间比较用方差分析；计数资料采用率(%)表示，组间比较用卡方检验；检测方法诊断评价指标用灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征(receiver operator charactreistic，ROC)曲线下面积(area under curve，AUC)表示(各指标的意义及计算方法见孙振球主编《医学统计学》第4版[10])。HPV E6/E7mRNA病毒载量与病理组织分级间的关系用Spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般情况

163例患者的年龄为30～40岁，平均年龄(35.7±1.3)岁，以组织病理活检为金标准，其中宫颈炎84例，CIN I 26例，CIN II 29例，CIN III 22例，SCC 2例。HPV E6/E7mRNA阳性77例(47.2%)；HPV DNA基因分型阳性136例(83.4%)；细胞学阳性109例(66.9%)；检出频率较高的5种HPV型别依次为16、58、52、18、33。

二、HPV E6/E7mRNA、HPV DNA基因分型、细胞学对宫颈病变诊断价值的比较

以组织病理活检为金标准，活检结果≥CIN II 53例，<CIN II 110例。HPV E6/E7mRNA、HPV DNA基因分型、细胞学检测宫颈病变≥CIN II的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及ROC曲线下面积AUC(见表1)。三种方法检测宫颈病变≥CIN II的灵敏度均较高，差异无统计学意义；HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变≥CIN II特异度高于细胞学和HPV DNA基因分型，差异有统计学意义；同样，HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变的PPV、NPV、PLR、AUC等判断诊断效能的指标均高于另外两种检测方法，差异均有统计学意义。

表1HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA分型、细胞学对宫颈病变的诊断价值分析
Table1Diagnostic value of HPV E6 / E7 mRNA, HPV DNA genotyping and cytology in cervical lesion

Note:Se=Sensitivity; Sp=Specificity; PPV=Positive predict value; NPV=Negative predict value; PLR=Positive likelihood ratio; NLR=Negative likelihood ratio；Compared with HPV DNA genotyping and cytology,*P<0.05

三、三种检测方法对宫颈病变分级的阳性检测能力

在CIN II、 CIN III和宫颈癌等病变中，三种检测方法的阳性率均较高，但差异均无统计学意义。在CIN I病变中三种方法的阳性率差异具有统计学意义(P<0.01)，HPV DNA基因分型的阳性率最高，HPV E6/E7mRNA的阳性率最低。同样，在无HPV感染的宫颈炎病变中，三种检测方法的阳性率差异亦有统计学意义(P<0.01)，HPV E6/E7mRNA的阳性率远低于细胞学和HPV DNA基因分型。见表2。

Table2The positive rates of HPV E6/E7 mRNA, HPV DNA genotyping and cytology in different pathological grades of cervical lesion

Note: Compared with cytology and HPV DNA genotyping in groups of cervicitis and CINI,*P<0.01.

四、不同宫颈病变级别中HPV E6/E7mRNA表达水平

随着宫颈病理级别的加重，HPV E6/E7 mRNA的拷贝值增加(见表3)。HPV E6/E7 mRNA的拷贝值与宫颈病变程度呈正相关，相关系数r=0.498，具有统计学意义(P<0.01)。

表3不同宫颈病变级别中HPV E6/E7mRNA表达水平

Table3HPV E6 / E7 mRNA expression levels in different grads of cervical lesion

讨论

流行病学研究显示，80%以上的女性一生中都会感染HPV，但大多数为一过性感染，不会导致病变发生，两年内机体自然清除率可达79%～91%[11]，因此在临床中检测到HPV阳性就给予处理，势必造成过度诊疗并增加女性不必要的心理负担。宫颈病变也存在着病变的消退、持续和进展等情况，有学者研究报道宫颈异常增生中CIN I自然消退率达90%(特别是年轻女性)，CIN II的转归率约40%，CIN III的转归率约20%～30%，显然高级别病变的转归明显低于低级别病变，高级别病变的女性进展为宫颈癌的风险显著高于正常女性。因此能早期准确地检测出宫颈病变(特别是高级别病变)而非一过性病毒感染，可及时阻断罹患宫颈癌的风险和减少癌症治疗所花费的费用和痛苦。尽管国际上对HPV阳性的处理不断的规范化，但是假阳性高仍是实际工作中的棘手问题，并给宫颈癌精准筛查带来困惑。目前，宫颈癌检测主要以细胞学和病毒基因诊断方法为主，细胞学以观察宿主细胞形态改变为主，其应用史有60多年，在降低全球宫颈癌发病率和死亡率方面做出了巨大贡献[12]，但仍有不足，结果因依赖于细胞学阅片医生而存在主观性。病毒学(HPV DNA/mRNA)以检测基因分子为基础，近10余年来发展迅速，依靠仪器检测分析，较细胞学客观更有优势。其中HPV DNA发展迅速已有超越细胞学的趋势[13]，其检测方便且灵敏度较细胞学高，但是HPV DNA无法判断感染阶段，往往检测出大量单纯性感染而假阳性率高，理论上HPV E6/E7mRNA与病变关系更密切，或许可弥补HPV DNA分型和细胞学的方法缺陷。

本次临床研究结果显示，HPV E6/E7mRNA在检测宫颈高级别上皮内病变时显示出与HPV DNA基因分型相似的灵敏度，且其特异度、阳性预测值、阴性预测值及阳性似然比均较细胞学和HPV DNA基因分型高，分析三者的受试者工作特征曲线，HPV E6/E7mRNA的ROC曲线下面积AUC为0.793，高于细胞学和HPV DNA分型，说明HPV E6/E7mRNA对宫颈病变诊断准确性高于细胞学和HPV DNA分型。由此可知，HPV E6/E7mRNA阴性对病变的排除性和阳性对病变的预测性优于细胞学和HPV DNA分型，这与Iftner等的研究结论一致[14-16]。进一步分析三种方法对各宫颈病变的检测能力，HPV E6/E7mRNA与细胞学、HPV DNA分型在检测低级别宫颈病变中(宫颈炎和CIN I)的阳性率差异具有统计学意义(P<0.01)，其中HPV E6/E7mRNA的阳性率最低。在高级别病变中(CIN II及以上病变)三种方法的阳性率差异无统计学意义，该结论与Szarewski等的研究一致[17]。而HPV E6/E7mRNA在CIN I的阳性率最低，可能是由于绝大多数CIN I会自然消退，其基因整合程度低、mRNA表达量少未达检测阈值，间接提示在低级别病变中HPV E6/E7mRNA的恶性转化能力低。在宫颈炎组织中，HPV E6/E7mRNA、HPV DNA分型、细胞学的阳性率分别为27.4%、53.6%、81.0%，说明HPV DNA分型的假阳性率最高，HPV E6/E7mRNA假阳性率最低。在病理活检为正常或炎症、CIN I、CIN II、CIN III、宫颈鳞癌时，随着宫颈病变程度增加HPV E6/E7mRNA的拷贝值升高。反过来可推测HPV E6/E7mRNA拷贝数高的患者，有可能为宫颈高级别病变，检测HPV E6/E7mRNA的表达量可对宫颈癌的风险评估提供一定的意义，Castle等的临床分析也显示HPV E6/E7mRNA表达水平与病变严重程度相关[18-19]。

宫颈癌筛查的目的是及时发现宫颈高级别病变或癌变并给予阻断治疗。本研究结果表明HPV E6/E7mRNA对宫颈高级别病变的诊断效能优于细胞学和HPV DNA分型，可更准确快速地检测出高危人群，在宫颈病变或癌变筛查中具有潜在的临床应用价值，但仍需更多大样本多中心的研究进一步证实。

1 Plummer M,de Martel C,Vignat J,et al.Global burden of cancers attributable to infections in 2012:a synthetic analysis.Lancet Glob Health,2016,4:e609-e616.

2 Graham SV,Faizo AA.Control of human papillomavirus gene expression by alternative splicing.Virus Res,2017,231:83-95.

3 Ganguly N,Parihar SP.Human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins as risk factors for tumorigenesis.J Biosci,2009,34:113-123.

4 Nakagawa S,Yoshikawa H,Yasugi T,et al.Ubiquitous presence of E6 and E7 transcripts in human papillomavirus-positive cervical carcinomas regardless of its type.J Med Virol,2000,62:251-258.

5 Carter JR,Ding Z,Rose BR.HPV infection and cervical disease:a review.Aust N Z J Obstet Gynaecol,2011,51:103-108.

6 Zhao X,Cui Y,Jiang S,et al.Comparative study of HR HPV E6/E7 mRNA and HR-HPV DNA in cervical cancer screening.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014,94:3432-3435.

7 Maggino T,Sciarrone R,Murer B,et al.Screening women for cervical cancer carcinoma with a HPV mRNA test:first results from the Venice pilot program.Br J Cancer,2016,115:525-532.

8 Reid JL,Wright TJ,Stoler MH,et al.Human papillomavirus oncogenic mRNA testing for cervical cancer screening:baseline and longitudinal results from the CLEAR study.Am J Clin Pathol,2015,144:473-483.

9 Nayar R,Wilbur DC.The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology:A Historical Perspective.Acta Cytol,2017,61:359-372.

10 孙振球,主编.医学统计学.第四版.北京:人民卫生出版社,2014:597-601.

11 Plummer M,Schiffman M,Castle PE,et al.A 2-year prospective study of human papillomavirus persistence among women with a cytological diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance or low-grade squamous intraepithelial lesionJ.J Infect Dis,2007,195:1582-1589.

12 Naucler P,Ryd W,Tornberg S,et al.Human papillomavirus and Papanicolaou tests to screen for cervical cancer.N Engl J Med,2007,357:1589-1597.

13 Practice Bulletin No.168 Summary:Cervical Cancer Screening and Prevention.Obstet Gynecol,2016,128:923-925.

14 Iftner T,Becker S,Neis KJ,et al.Head-to-Head Comparison of the RNA-Based Aptima Human Papillomavirus (HPV) Assay and the DNA-Based Hybrid Capture 2 HPV Test in a Routine Screening Population of Women Aged 30 to 60 Years in Germany.J Clin Microbiol,2015,53:2509-2516.

15 Ge Y,Christensen P,Luna E,et al.Performance of Aptima and Cobas HPV testing platforms in detecting high-grade cervical dysplasia and cancer.Cancer,2017,125:652-657.

16 Ren C,Zhu Y,Yang L,et al.Diagnostic performance of HPV E6/E7 mRNA assay for detection of cervical high-grade intraepithelial neoplasia and cancer among women with ASCUS Papanicolaou smears.Arch Gynecol Obstet,2017,297:425-432.

17 Szarewski A,Mesher D,Cadman L,et al.Comparison of seven tests for high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal smears:the Predictors 2 study.J Clin Microbiol,2012,50:1867-1873.

18 Castle PE,Eaton B,Reid J,et al.Comparison of human papillomavirus detection by Aptima HPV and cobas HPV tests in a population of women referred for colposcopy following detection of atypical squamous cells of undetermined significance by Pap cytology.J Clin Microbiol,2015,53:1277-1281.

19 Haedicke J,Iftner T.A review of the clinical performance of the Aptima HPV assay.J Clin Virol,2016,76 Suppl 1:S40-S48.

DiagnosticvalueofhumanpapillomavirusE6/E7mRNAinthedetectionofcervicallesions

ObstetricsandGynecologyofXijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the diagnostic value of human papillomavirus (HPV) E6/E7 mRNA in cervical lesions screening.MethodsFrom December 2016 to May 2017 in the department of obstetrics and gynecology of Xijing Hospital, we collected 163 women who were screened for cervical lesion in the combined test of cytology and HPV DNA genotyping, then conducted transvaginal biopsy. Meanwhile all patients were detected through HPV E6/E7 mRNA testing, and the cervical biopsy pathological diagnosis was used as the gold standard. We compared HPV E6/E7 mRNA, cytology, and HPV DNA genotyping to detect CINII+ in the indicators of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, positive likelihood ratio, negative likelihood ratio, and area under the receiver operating characteristic curve (AUC). We also compared the ability of three methods to detect cervical lesion, and the relationship between HPV E6/E7 mRNA expression level and pathological grades.ResultsThe results of indicators of HPV E6/E7 mRNA, HPV DNA genotyping and cytological test for screening cervical lesion CINII+ were as follows: The sensitivities were 86.8%, 88.7% and 88.7%; The specificities were 71.8%, 19.1% and 43.6%; The positive predictive values were 59.7%, 34.6% and 43.1%; The negative predictive values were 91.8 %, 77.8% and 88.8%; The positive likelihood values were 3.1, 1.1 and 1.6; The negative likelihood values were 0.2, 0.6 and 0.3; The AUC were 0.793, 0.539 and 0.662, respectively. Diagnostic performance of HPV E6/E7 mRNA was higher than that of HPV DNA genotyping and cytological test. There was statistical significance between different pathological grades and HPV E6/E7 mRNA expression levels (P<0.01), and HPV E6/E7 mRNA expression levels were positively correlated to cervical lesion grads (P<0.05).ConclusionHPV E6/E7 mRNA has clinical significance for the diagnosis of cervical lesion, and clinicians should pay attention to it.