表1高危人群中聋人和非聋人的耳聋基因突变率和基因型构成比情况[例(%)]
Table1Gene mutation rates and comparisons of genotypes in high-risk subjects with hearing loss and without hearing loss [n(%)]
·遗传与出生缺陷·
查树伟 许豪勤 吕年青 查佶 周定杰 傅雅丽 石慧 邹文霓 孙庆 张伟婧
【摘要】目的通过耳聋基因筛查分析聋人家庭及高危夫妇耳聋基因突变类型并指导生育。方法2014年6月—2015年8月在江苏省镇江市、泰兴市、如皋市、高邮市、涟水县和沭阳县6个孕前耳聋基因筛查项目点，对1 203例耳聋基因高危人群(聋人904例和非聋人299例)，采用遗传性耳聋基因芯片进行检测。结果高危人群耳聋基因突变总携带率为48.2%，其中聋人为48.0%，非聋人为48.8%，两者差异无统计学意义，而聋人和非聋人单一位点阳性的4个基因型构成比差异有统计学意义。在36个有聋人的家庭和108对高危人群夫妇中存在37个耳聋基因突变类型(74种组合)，经对144例(个或对)聋人家庭和高危夫妇耳聋基因筛查分析，有101例存在生育聋儿的可能。结论对聋人家庭和高危夫妇进行耳聋基因筛查分析和生育指导能有效防止聋儿出生的发生风险。
【关键词】耳聋； 基因； 突变； 筛查； 遗传咨询
作者单位：210036 南京，江苏省计划生育科学技术研究所(查树伟，许豪勤，吕年青，周定杰，傅雅丽，石慧，邹文霓，孙庆，张伟婧)；美国费城儿童医院(查佶)
目前，中国人群携带突变耳聋基因的比例约为12%，每1 000个新生儿中就有2～3名聋儿，其中一半以上是由耳聋基因突变导致的遗传性耳聋[1]。如果进行科学的干预和指导，可以帮助这些家庭减少生育(再生育)聋儿的风险。本文就孕前耳聋基因筛查项目对聋人家庭及高危夫妇耳聋基因筛查进行了分析和生育指导。
选取2014年6月—2015年8月在江苏省的镇江、泰兴、如皋、高邮、涟水和沭阳6个项目点进行耳聋基因筛查项目检测的孕前耳聋基因高危人群[2]以及已生育的子女1 203例。入选标准为本人听力检测有听力损失和(或)家族成员有耳聋患者，即耳聋基因高危人群。筛查检测对象分为聋人904例和非聋人299例，包含聋人家庭中父母和1个子女(31个聋人家庭共93例)、父母和2个子女(5个聋人家庭共20例)以及耳聋基因高危人群夫妇(夫妇共108对216例)生育(再生育)分析以及夫妇仅一方为耳聋基因高危人群等(874例)研究对象的耳聋基因突变类型。
1.标本采集：对确定耳聋基因筛查的人群收集标本，相对集中实施标本的采集，便于标本的集中寄送。采集静脉血2～3 ml，采血者不需要空腹，血样标本使用抗凝剂为EDTA或枸橼酸钠的真空塑料采血管。全血在生物冰袋条件下运输，并在12 h内送达实验室，-20 ℃保存，尽量新鲜血液进行DNA提取。
2.芯片检测：采用遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒(博奥生物有限公司)对GJB2(35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT)、GJB3(538 C>T)、SLC26A4(2168 A>G、IVS7-2 A>G)和线粒体DNA 12S rRNA(1494 C>T、1555 A>G)4个耳聋相关基因的9个致聋突变位点，按照实验操作流程[3]进行检测和结果判读。
3.听力测试：采用语声测试法，按WHO听力损失的标准[4]评估听力。
4.统计学处理：采用SPSS 17.0软件处理数据。统计方法包括统计学描述，计数资料采用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
在1 203例耳聋基因高危人群中，其中男性599例(49.8%)，平均年龄(25.5±13.5)岁；女性604例(50.2%)，平均年龄(26.7±12.5)岁。通过语声测试法评估高危人群听力，其中聋人904例(75.1%)、非聋人299(24.9%)。
经芯片检测，高危人群耳聋基因突变总携带率为48.2%(580/1 203)，其中聋人耳聋基因突变总携带率为48.0%(434/904)，非聋人为48.8%(146/299)，两者之间差异无统计学意义。表1中阳性表示耳聋基因芯片检测结果存在纯合(均质)耳聋基因突变、或复合耳聋基因突变、或杂合(异质)耳聋基因突变，阴性表示耳聋基因芯片检测结果9个位点均为野生型。聋人和非聋人单一位点阳性的4个基因型构成比差异有统计学意义。见表1。
表1高危人群中聋人和非聋人的耳聋基因突变率和基因型构成比情况[例(%)]
Table1Gene mutation rates and comparisons of genotypes in high-risk subjects with hearing loss and without hearing loss [n(%)]
*P<0.05
在31个有聋人的家庭中父亲、母亲和1个子女同时进行耳聋基因筛查，筛查检测结果的家庭耳聋基因突变类型有21种，见表2。表中的35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT、538 C>T、2168 A>G、IVS7-2 A>G、1494 C>T和1555 A>G分别表示芯片检测的9个位点，9个位点野生型(wildtype at all nine loci)可认为正常，纯合(homozygous)、杂合(heterozygous)、均质(homoplasmic)和异质(heteroplasmic)分别表示该位点存在的耳聋基因纯合突变、杂合突变、均质突变和异质突变，其他位点为野生型。
在5个有聋人的家庭中父亲、母亲和2个子女同时进行耳聋基因筛查，检测的家庭耳聋基因突变类型见表3。
表2父母和1个子女家庭检测的耳聋基因突变类型
Table2Types of deafness gene mutations in family with parents and one child
Note: 9 [○] represents wildtype at all nine loci; [∽] represents heterozygous mutation; [∞] represents homozygous mutation; [●] represents homoplasmic mutation
表3父母和2个子女家庭检测的耳聋基因突变类型
Table3Types of deafness gene mutations in family with parents and two children
Note: 9 [○] represents wildtype at all nine loci; [∽] represents heterozygous mutation; [∞] represents homozygous mutation; [●] represents homoplasmic mutation
耳聋基因筛查高危人群中同时检测夫(男方)妇(女方)双方共108对，夫妇耳聋基因突变有48种组合，合并为11种耳聋基因突变类型：
(1)夫妇的一方为9个位点均为野生型，另一方为单一位点杂合突变(类型编号3-01)，共17例4种组合(176 del 16杂合1例，235 del C杂合9例，299 del AT杂合1例，IVS7-2 A>G杂合6例)。
(2)夫妇的一方为9个位点均为野生型，另一方为单一位点纯合突变(类型编号3-02)，共9例4种组合(176 del 16纯合1例，235 del C纯合5例，299 del AT纯合2例，IVS7-2 A>G纯合1例)。
(3)夫妇的一方为9个位点均为野生型，另一方为两个位点复合突变(类型编号3-03)，共9例6种组合(176 del 16杂合235 del C杂合2例，176 del 16杂合299 del AT杂合1例，235 del C杂合299 del AT杂合2例，235 del C杂合2168 A>G杂合1例，235 del C杂合IVS7-2 A>G纯合1例，2168 A>G杂合IVS7-2 A>G杂合2例)。
(4)夫妇双方都是单一位点杂合突变(类型编号3-04)，共26例11种组合(176 del 16杂合与235 del C杂合1例，176 del 16杂合与299 del AT杂合2例，双方235 del C杂合7例，235 del C杂合与299 del AT杂合5例，235 del C杂合与538 C>T杂合1例，235 del C杂合与IVS7-2 A>G杂合2例，双方299 del AT杂合1例，299 del AT杂合与IVS7-2 A>G杂合1例，538 C>T杂合与2168 A>G杂合1例，2168 A>G杂合与IVS7-2 A>G杂合2例，双方IVS7-2 A>G杂合3例)。
(5)夫妇的一方为单一位点杂合突变，另一方为单一位点纯合突变或两个位点复合突变(类型编号3-05)，共10例6种组合(235 del C杂合与235 del C纯合3例，235 del C杂合与235 del C杂合299 del AT杂合1例，299 del AT杂合与235 del C杂合299 del AT杂合1例，2168 A>G杂合与235 del C纯合1例，IVS7-2 A>G杂合与235 del C纯合2例，IVS7-2 A>G杂合与IVS7-2 A>G纯合2例)。
(6)夫妇双方都是单一位点纯合突变或两个位点复合突变(类型编号3-06)，共3例3种组合(235 del C纯合与176 del 16杂合235 del C杂合1例，235 del C纯合与235 del C杂合299 del AT杂合1例，双方235 del C杂合299 del AT杂合1例)。
(7)男方线粒体突变和女方9个位点均为野生型(类型编号3-07)，共10例2种组合(1494 C>T均质1例，1555 A>G均质9例)。
(8)男方线粒体突变和女方单一位点杂合突变(类型编号3-08)，共1例(1555 A>G均质与女方235 del C杂合1例)。
(9)男方线粒体突变和双方其他突变(类型编号3-09)，共5例4种组合(1555 A>G均质235 del C杂合与女方235 del C杂合1例，1555 A>G均质与女方235 del C纯合2例，1555 A>G均质与女方235 del C杂合299 del AT杂合1例，1555 A>G均质与女方IVS7-2 A>G杂合1例)。
(10)女方线粒体突变和双方其他突变(类型编号3-10)，共16例5种组合(1555 A>G均质11例，1555 A>G均质IVS7-2 A>G杂合与男方235 del C纯合1例，1555 A>G均质与男方235 del C杂合2例，1555 A>G均质与男方235 del C纯合1例，1555 A>G均质与男方IVS7-2 A>G杂合1例)。
(11)双方线粒体突变(类型编号3-11)，共2例2种组合(1555 A>G均质1例，男方1555 A>G均质与女方1555 A>G异质1例)。
在以上36个家庭和108对夫妇中4个基因9个位点检测有37个耳聋基因突变类型(74种组合)，生育(或再生育)咨询指导风险分析结果，子女不携带相关突变基因的为类型编号1-04、2-03和3-07，共有13例；部分子女携带相关突变基因的为类型编号1-14、1-20、3-01和3-08，共有20例；全部(或>1/2)子女携带相关突变基因的为类型编号1-02和3-02，共有10例；全部(或>1/2)子女携带相关突变基因并可能生育聋儿的为类型编号1-01、1-03、1-05、1-06、1-07、1-08、1-09、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-21、2-01、2-02、2-04、3-03、3-04、3-05、3-06、3-09、3-10和3-11，共有101例。见表4。
表4生育(或再生育)咨询指导风险分析
Table4Clinical guidance and risk analysis of childbearing
Note: “carrier” refers to child carrying deafness gene mutations, which are inherit from parents; “√” represents fertility risk; “×” represents no fertility risk.
对有生育或再生育意愿的聋人家庭及高危夫妇进行孕前耳聋基因筛查可以了解该人群耳聋基因携带状况，并进行生育风险评估[5]、咨询指导和发现携带耳聋基因后防治[6]。
本研究中高危人群筛查检测结果，聋人和非聋人耳聋基因突变携带率分别为48.0%和48.8%，与相关文献报道的耳聋患者检测耳聋基因突变携带率，如张旭等报道的43.6%、胡煜等报道的44.1%、彭新等报道的52.2%和王荷溪等报道的55.2%相接近[7-10]。聋人和非聋人的不同耳聋基因携带情况存在差异，聋人携带SLC26A4和mtDNA 12S rRNA耳聋基因较多，而非聋人携带GJB2耳聋基因较多，差异的原因有待增大人群数量来确定和分析。研究发现GJB2缺陷可能通过引起耳蜗发育异常，毛细胞退化以及内耳蜗电位降低导致先天性耳聋[11-13]。进一步分子机理研究认为小鼠中GJB2敲除导致的耳蜗内miRNA(如miR-96)的表达异常可能导致其耳蜗发育异常[14]，而耳蜗中非感觉性细胞GJB2表达降低会导致影响内耳毛细胞的成熟[15]。GJB3耳聋基因主要表达于耳蜗螺旋韧带细胞的III型纤维细胞，其导致先天性耳聋的机制不明[16]。SLC26A4基因编码的Pendrin蛋白表达于内淋巴管和内淋巴囊上皮细胞及椭圆囊和球囊边缘的神经细胞中，介导细胞碳酸氢钠离子、氯离子和碘离子等的交换。Pendrin蛋白表达异常可能通过影响细胞内外阴离子的转运，从而影响声音传递导致迟发型耳聋[17-18]。关于mtDNA 12S rRNA突变引发药物导致耳聋的病理机制有两种假说，一种认为12S rRNA突变加剧了线粒体内核糖体mRNA的误读从而导致线粒体功能失调[19-20]，另一种认为12S rRNA的1555A>G突变引起的12S rRNA的超甲基化与耳聋症状具有相关性[21]。
占遗传性耳聋70%的非综合征型耳聋主要为孟德尔单基因遗传病，按遗传方式分为常染色体显性遗传(DFNA)、常染色体隐性遗传(DFNB)、X-连锁(DFNX)、Y-连锁(DFNY)和线粒体遗传，其中DFNX较为少见，DFNY罕见报道[1]，本研究主要探讨占约80%DFNB和线粒体遗传。对于DFNB，聋儿的父母多为拥有正常听力的突变耳聋基因携带者，再次生育其后代25%为耳聋患者。聋儿的每个同胞有25%的几率为耳聋患者，50%的几率是正常听力的携带者，25%为正常人。聋人与正常人婚配的后代100%为携带者，聋人与正常听力的携带者的后代50%为耳聋患者，聋人与携带相同致聋基因的耳聋患者结合的后代100%为耳聋患者，男女患病机会均等。对于线粒体基因突变导致的耳聋，其再发风险率的估计比较复杂，带有突变线粒体DNA(mtDNA)的个体是否发病受许多因素影响，与突变的性质和严重程度、突变mtDNA所占比例、核基因产物的调节以及不同组织细胞的能量阈值均有一定关系。对于均质性的1555 A>G、1494 C>T突变，符合经典的母系遗传方式，mtDNA的突变可通过母亲传给后代，后代男女均可发病，但只有女性可将突变的mtDNA继续传给下一代，而男性则不再下传[1]。
本研究的144例(个或对)聋人家庭和高危夫妇的检测中有37个耳聋基因突变类型(74种组合)，对于这些聋人家庭和高危夫妇可以参考表4给予生育(或再生育)咨询指导风险分析。其中有101例存在生育聋儿的可能，建议在生育(或再生育)时进行产前诊断，必要时运用胚胎移植前遗传学诊断技术(PGD)或采用临床其他诊疗方法，可以减少或避免聋儿的出生。
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[Abstract]ObjectiveTo analyze the common deafness gene mutations among families with hearing loss history or high-risk couples using genetic screening and to provide clinical guidance for childbearing.Methods1203 high-risk cases (including 904 subjects with hearing loss and 299 subjects without symptoms of hearing loss) were enrolled from six prenatal deafness genetic screening sites, including Zhenjiang, Taixing, Rugao, Gaoyou, Lianshui and Shuyang from June 2014 to August 2015. Subjects were screened for genetic mutations using heredity deafness gene chip.Results48.2% of high-risk subjects carry deafness gene mutations, while it’s 48.0% among the subjects with hearing loss and 48.8% among those without symptoms of hearing loss. There was no significant difference between the two groups. However, there was significant difference in 4 genotypes between the two groups. There were 37 types of deafness gene mutation (with 74 combinations) in 36 families with hearing loss and 108 high-risk couples. Further screening analysis demonstrated that 101 of them have the possibility to conceive children with hearing loss among those 144 families/high-risk couples.ConclusionGenetic screening for deafness gene among families with hearing loss history and high-risk couples and providing childbearing guidance could effectively prevent birth defects of congenital deafness.
[Keywords]deafness； gene； mutation； screening； genetic counseling
通讯作者：查树伟(1151623802@qq.com)；许豪勤(1325825613@qq.com)
基金项目：江苏省科技厅临床医学科技专项-公共卫生关键技术应用研究(BL2014098)；江苏省出生缺陷筛查及诊断实验室能力建设(BM2015020)
(收稿日期：2017-11-17)