表示，组间差异比较前行方差齐性检验，方差齐者行t检验，方差不齐者行秩和检验；计数资料行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。·妇儿临床·
Toll样受体(Toll-like receptors；TLRs)作为主要的固有免疫受体类型，在调节免疫反应，启动继发性损伤中发挥关键作用[1]。TLR-4作为TLRs家族的重要成员，在识别并结合损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns；DAMPs)，启动炎症反应的过程中发挥关键作用。TLR-4通过与相应受体结合，启动下游的髓样分化因子88(MyD88)依赖/Myd88非依赖信号通路，进而激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，促进细胞增殖、分化、分泌大量细胞因子[2]。近年研究表明，慢性炎症与肿瘤的发展密切相关，而介导炎症的TLR4与多种肿瘤的生物学行为密切相关，是近年来研究热点之一[3]。在胶质瘤等恶性肿瘤的研究中已经证明，TLR4表达上调明显，且TLR1到TLR10均有不同程度表达升高。有文献报道，TLR4在宫颈癌中表达明显增高，且表达程度与肿瘤病变程度呈高度相关性[4]。但是，目前TLR4在宫颈癌中表达增加的作用尚不明确，其是否影响宫颈癌细胞增殖、迁移仍有待进一步探讨。
因此，本研究拟检测宫颈癌组织和宫颈癌细胞中TLR4/NF-κB表达改变，并通过干扰TLR4表达，观察TLR4对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。
一、资料
收集本院于2017年4月—2018年4月就诊并行手术治疗的患者术中宫颈癌组织及癌旁组织31例，诊断依据病理结果。人宫颈癌细胞株HCE1由我院实验中心提供，兔多克隆抗体TLR4，Myd88，ERK1/2及NF-κB均购自美国Abcam公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测试剂盒购自中国碧云天公司，DMEM/F12培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，Trizol Reagent购自Invitrogen公司，mRNA逆转录试剂盒购自Thermo公司，PCR mix购自日本Toyobo公司，TLR4 沉默与过表达质粒均购自中国百奥迈科生物技术有限公司。
二、方法
1. 采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)比较宫颈癌组织及癌旁组织中TLR4/ NF-κB的表达。根据人宫颈癌细胞株HCE1细胞TLR4表达情况，分为Blank 、阴性对照、TLR4沉默、TLR4过表达4组。采用CCK8、划痕实验、Transwell实验检测TLR4对细胞增殖、迁移、侵袭，并进一步检测Myd88，ERK1/2 及NF-κB信号分子改变。
2.细胞培养：常规培养人宫颈癌细胞株HCE1及原代宫颈上皮细胞。在细胞生长稳定、呈对数期时用于实验。
3.分组与瞬时转染：接种人宫颈癌细胞株HCE1，在37 ℃ 5% CO2 细胞培养箱中，含 10% FBS 的细胞培养液中培养，50%～60% 融合时，采用Lipofectamine 3000瞬时转染。共分4组： Blank 组：常规培养的宫颈癌细胞；阴性对照(negative control，NC)组：转染TLR4 NC(100 nmol/ml)的宫颈癌细胞；TLR4沉默组：转染TLR4 siRNA(100 nmol/ml)的宫颈癌细胞；TLR4过表达组：转染TLR4 过表达质粒(100 nmol/ml)的宫颈癌细胞。严格按照脂质体法进行转染，6 h 内用 OMEM 培养基进行培养。
4.qRT-PCR：获得患者癌组织及癌旁组织，以及相应细胞系样本，均严格按照RNAgent Isolation System说明书，抽提总RNA。取1 ug总RNA，严格按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA。PCR反应在PE公司的GeneAmp8 5700型PCR扩增仪上进行，严格按照SYBR green说明书加样，总反应体系20 ul，各样本加cDNA 2ul；SYBR green 10 ul；商品化引物 2 ul(TLR4，NF-κB，上海生工，中国；GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司，美国)；RANaseRree去离子水 2 ul。按两步法反应94℃ 30 s，58℃ 30 s，反复40个循环以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照进行分析。
5.细胞增殖实验：在96孔板中每孔接种5×103个细胞，每组设置4个复孔。将细胞刚好贴壁记为0 h，于12 h利用CCK-8检测试剂盒检测细胞增殖；每孔加入10 ul CCK-8溶液，空白对照孔加10 μl 0.9%生理盐水，在细胞培养箱中孵育1 h，然后用酶标仪在570 nm处测定各孔的吸光度(A)值。
6.细胞划痕实验：细胞按每孔约5×105个细胞的密度接种到6孔板，培养24 h至细胞伸展，用无菌200ul的枪头在细胞层垂直、快速划痕。标准条件培养48 h后观察划痕愈合。
7.侵袭实验：Transwell小室(Millipore，USA)底部铺入50 ul Basement Membrane Matrix(Corning, USA，1:2稀释)，置于细胞孵箱中2 h。收获细胞，制成每200 ul DMEM(GIBECO，USA)中含6×104个细胞悬液。Transwell上室加入200 ul DMEM细胞悬液，下室加入800 ul含10%胎牛血清DMEM，置于细胞培养箱中。侵袭48 h后取出小室，多聚甲醛中固定10 min，结晶紫中染色3 min。PBS洗净结晶紫，并用棉签轻轻擦拭Transwell小室上室底部。晾干后，将小室倒置于显微镜下观察并拍照，计算细胞数目。
8.Western blot检测：按不同因素处理细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度，采用5×上样缓冲液稀释，使用12%分离胶电泳，转膜90min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST漂洗10 min×3次，用5%TBST稀释的BSA稀释一抗，分别与膜接触4℃孵育过夜后，用TBST漂洗10min×3次，加二抗室温下孵育1 h 后，用TBST 洗膜10 min× 3 次，在Gene Gnome曝光仪上曝光并拍照。
9.统计学方法：采用SPSS 17.0(SPSS Inc.，USA)进行数据分析。计量资料以表示，组间差异比较前行方差齐性检验，方差齐者行t检验，方差不齐者行秩和检验；计数资料行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
一、TLR4/NF-κB在组织和细胞中的表达：在mRNA水平，肿瘤组织TLR4的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P=0.001)；宫颈癌细胞株HCE1中TLR4的相对表达量显著高于正常宫颈上皮细胞，差异有统计学意义(P=0.001)，见图1A。肿瘤组织NF-κB的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P=0.011)；HCE1中NF-κB的相对表达量显著高于正常宫颈上皮细胞，差异有统计学意义(P=0.003)，见图1B。
图1 TLR4/NF-κB在不同组织和细胞中的表达比较
Figure 1 Comparison of TLR4/NF-κB expression in different tissues and cells
二、TLR4对细胞增殖能力的影响：TLR4沉默组HCE1细胞增殖能力(0.8±0.4)较NC组(1.2±0.4)显著下降，差异有统计学意义(P=0.022)；而TLR4过表达组HCE1细胞增殖能力(1.9±0.5)较NC组(1.2±0.4)显著升高，差异有统计学意义(P=0.003)，见图2。
三、TLR4对细胞迁移、侵袭能力的影响：TLR4沉默组细胞愈合面积比例显著低于NC组(P=0.001)，而TLR4过表达组细胞愈合面积比例显著高于NC组(P=0.001)，见图3C。另外，TLR4沉默组细胞穿膜细胞数明显少于NC组(P=0.001)，而TLR4过表达组穿膜细胞数明显多于NC组(P<0.000)，见图3D。结果提示，过表达TLR4可以促进宫颈癌细胞迁移、侵袭。
图2 细胞增殖能力改变
Figure 2 Changes in cell proliferation
Compared with NC group,#P<0.05.
图3 细胞迁移、侵袭能力改变
Figure 3 Changes in cell migration and invasiveness
Compared with NC group,#P<0.05.
四、Myd88/NF-κB信号通路表达改变：为进一步探究TLR4促进宫颈癌细胞株HCE1增殖、迁移和侵袭的机制，结果显示，TLR4沉默组Myd88(P=0.015)，pERK1/2(P=0.007)及pNF-κB(t=2.762,P=0.024)表达显著低于NC组，而TLR4过表达组Myd88(P=0.001)，pERK1/2(P=0.001)及pNF-κB(P=0.011)表达显著高于NC组，见图3。由此可见，TLR4可通过激活Myd88，ERK1/2及NF-κB信号分子，促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭，见图4。
图4 不同组别细胞Myd88，pERK1/2及pNF-κB蛋白表达改变
Figure 4 Expression of Myd88, pERK1/2 and pNF-κB in different groups
Medzhitov等于1997年发现人类第一个与果蝇Toll蛋白相似的蛋白受体-TLR4。TLR4是TLR家族11亚型中最重要的成员，研究最多，不仅广泛表达于NK细胞、巨噬细胞等免疫原性细胞，也表达于胶质瘤、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤[5]。近年研究表明，慢性炎症与肿瘤的发展密切相关，而介导炎症的TLR4与多种肿瘤的生物学行为密切相关，是近年来研究热点之一。
研究表明，TLR4在很多肿瘤细胞系和肿瘤组织中表达上调。Yang等报道在人乳腺癌细胞中，TLR1到TLR10均有不同程度表达升高，尤其是TLR4表达上调最明显[1]。有研究发现大肠癌中TLR4的表达显著高于癌旁组织，且与TGF-β、VEGF之间表达存在明显相关性[6-7]。在宫颈癌中，有文献报道，TLR4在肿瘤组织中的表达明显增高，且表达程度与肿瘤病变程度呈密切相关性[8]。通过本研究进一步证实，TLR4、NF-κB在宫颈癌及宫颈癌HCE1细胞系中的相对表达明显增高。
目前，TLR4与宫颈癌病变程度相关性的机制仍不清楚。有研究认为，TLR4信号传导途径在肿瘤形成、凋亡抵抗和侵袭过程中发挥重要作用[9]。有研究表明，TLR4信号途径激活NF-κB促进炎性因子的产生，并激活AP-1促进生长因子的产生[10]。在胶质瘤中的研究表明，TLR4/NF-κB信号通路的过度激活与胶质瘤的侵袭、增殖密切相关[11]。但是，TLR4/NF-κB信号通路与宫颈癌增殖、迁移的关系目前仍缺乏文献报道。我们的研究证实，在宫颈癌中沉默TLR4的表达，可以显著抑制宫颈癌增殖、迁移、侵袭，而过表达TLR4可显著增强宫颈癌细胞增殖、迁移与侵袭。另外，TLR4下游的Myd88，ERK1/2及NF-κB信号分子随着TLR4表达改变而改变。
目前，肿瘤微环境在促进肿瘤增殖、迁移与侵袭中的作用逐渐受到重视。研究表明，通过激活TLR4受体，介导MyD88、IRAK、TRAF6、IKK信号途径激活，最终激活NF-κB，促进IL-1、IL-6、TNF-A等大量炎症因子的产生。而此类炎症因子有助于肿瘤细胞逃逸免疫原性细胞如T淋巴细胞、NK细胞攻击，促进肿瘤迁移。研究报道TLR4激活后可促进肿瘤生长和抵抗化学治疗，阻止TLR4激活则能减缓肿瘤生长及延长动物的生存期[12]。在宫颈癌中，过表达TLR4是否通过影响肿瘤微环境的机制促进肿瘤增殖、迁移、侵袭仍有待进一步探讨。
综上所述，TLR4/NF-κB在宫颈癌中过度激活，促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭。通过沉默TLR4可以抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭。在宫颈癌中，TLR4/NF-κB可能发挥促癌作用，可能是抗癌药物的重要靶点。
1 Yang S S,Tang L,Li R G,et al.The effects of subclinical hypothyroidism on serum lipid level and TLR4 expression of monocyte in peripheral blood of rats.Neuro Endocrinology Letters,2014,35:80-86.
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12 李刚,姚珍薇.ERK1/2信号转导通路在宫颈癌发病中的作用.山东医药,2007,47:118-119.