图1 大鼠正常动情周期
表1 第5周末4组大鼠血液指标比较
·实验研究·
多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种生殖异常和糖代谢紊乱并存的妇科内分泌性疾病，个体表现差异大，主要以高雄激素和/或胰岛素抵抗为主要特点[1-3]。高分子量脂联素(high-molecular weight Adiponectin,HMW APN)是脂联素多聚体中最具生物活性的形式，具有调节糖、脂代谢，增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用[4]。不少研究发现HMW APN与胰岛素抵抗关系密切。二甲双胍既可以降低血糖，改善胰岛素敏感性，又可以调节血脂，对PCOS患者临床症状有一定作用。本实验观察PCOS大鼠血清HMW APN水平及二甲双胍对HMW APN、性激素的调节作用及脂联素基因的影响，分析PCOS大鼠体内血清HMW APN水平变化及其与生理生化指标的关系，或可为PCOS的发病机制研究提供新思路，为治疗提供新的药物靶点。
1.材料
(1) 动物：选用健康4周龄雌性SD(Sprague Dawley)大鼠共40只，清洁级，体重80～120 g(购买于西安交通大学医学院实验动物中心)。
(2) 试剂及仪器设备：包括来曲唑(美国Selleck公司)，二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司),胰岛素、高分子脂联素酶联免疫试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)，酶标仪，恒温孵育箱，移液枪、真空采血管(北京博奥森生物技术有限公司)，性激素放免试剂盒(天津德普公司)等。
2.方法
(1) 动物模型建立及分组：40只4周龄雌性SD大鼠，体重(100±20)g,耳标标记，使用随机数字表平均分成4组：正常组(normal control，NC)、PCOS组、胰岛素抵抗组(insulin resistance，IR)、PCOS-IR组。每组2笼，每笼 5 只。所有大鼠在第0周适应性喂养1周，动物室内设置昼夜12 h 循环，自由饮水及摄食。从第1周开始进行造模，将之前设定为IR组和PCOS-IR组的大鼠给予60%高脂饲料喂养，其余2组给予普通饲料，高脂喂养至实验结束。PCOS造模期间每天4组大鼠在10:00、15:00分别做阴道涂片，连续监测14 d，直至明确获得每只大鼠的一个完整性周期，40只大鼠均存在正常动情周期(图1)，进入后续PCOS造模。第3周开始，之前设定为PCOS组和PCOS-IR组的大鼠给予灌服1 mg/kg的来曲唑溶解于1%羧甲基纤维素溶液,连续21 d[5-6]，NC组及IR组给予等体积1%羧甲基纤维素溶液。每日阴道液涂片并显微镜观察、记录涂片中细胞类型及判断所处发情周期，若PCOS及PCOS-IR组大鼠完全失去周期性变化(即持续处于间情期)，提示PCOS造模成功(第5周)。第5周末4组大鼠取尾静脉抽血测空腹血糖及空腹胰岛素，计算HOMA-IR结果提示(表1)：IR组、PCOS组、PCOS-IR组的HOMA-IR 均高于NC组，且差异有统计学意义(P<0.05)，提示5周高脂饮食诱导SD大鼠产生胰岛素抵抗，大鼠各组模型成功建立。造模过程中PCOS及PCOS-IR组大鼠各原因不明死亡2只，故造模成功后PCOS组为8只、PCOS-IR组为8只。
图1 大鼠正常动情周期
表1 第5周末4组大鼠血液指标比较
组别n空腹血糖 (mmol/L)空腹胰岛素 (mU/L)HOMA-IRNC组 104.13±0.8814.50±0.422.64±0.30IR组105.62±1.29*15.19±1.004.24±0.45*PCOS组85.07±0.9017.37±0.473.85±0.75*PCOS-IR组 86.06±0.45**21.90±0.745.72±0.37**
注:与NC组比较, *P <0.05,**P <0.001
(2) 实验方法：从第6周起，二甲双胍干预4周：PCOS-IR组给予二甲双胍(0.5 mg/g)，NC组、IR组、PCOS组均给予等体积的生理盐水。末次给药后，禁食禁水12 h后，行 OGTT 试验，以 50%葡萄糖溶液按 2 g/kg 灌胃，测 0 min、 30 min、 60 min 和 120 min 血糖，并留血清测OGTT胰岛素水平。计算 AUC；后用10%水合氯醛，0.30 ml/100g腹腔注射进行麻醉，经腹主动脉取血到无抗凝剂的离心管中，4℃静置20 min，离心，取血清，用于性激素等指标测定；分离取双侧卵巢，一侧用10%福尔马林溶液固定，留用于石蜡包埋切片，HE染色，另一侧置 1.5 ml 无酶EP管中，-80℃冰箱保存，用于Real-Time PCR检测。
(3) 大鼠阴道涂片方法:取待检查的雌鼠置于操作台上(避免未检查大鼠受其影响)，安抚并清理毛上的垫料，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指轻压其后腰背部，翻起尾巴露出阴道口，清理粪便后，用棉签蘸取少量生理盐水在大鼠阴道涂抹数次，涂片，吉姆萨染液染色并采集图片。
3.生化指标测定：血糖由罗氏血糖仪测定；稳态模型胰岛素抵抗指数 (homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)[7]：HOMA-IR=空腹胰岛素×FBG/22.5；OGTT血糖曲线下面积(AUC)：曲线下面积=1/2×(0小时血糖值+0.5小时血糖值)×0.5+1/2×(2小时血糖值+0.5小时血糖值)×1.5=0.25×(0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值)。阴道涂片用吉姆萨染色观察动情周期；放射免疫法检测促卵泡生成素、促黄体生成素、睾酮(上海岚派生物科技有限公司)；酶联免疫吸附测定法检测HMW APN、胰岛素水平(上海岚派生物科技有限公司)。
4.卵巢组织形态学观察：HE染色，200及400倍光学显微镜下观察卵巢形态学变化；RT-PCR检测并分析卵巢组织中Adiponectin、 AdipoR1和AdipoR2表达水平。
5.统计学处理：所有资料使用SPSS 21.0统计软件进行分析，实验数据以
表示，计量资料的组间比较分析采用方差分析或者t检验，线性相关分析采用spearman相关性分析法。P<0.05为差异有统计学意义。
1.实验中各组大鼠的空腹血糖及OGTT血糖变化
各组大鼠FBG(0周)差异无统计学意义(P>0.05)；造模成功时(第5周)，IR组、PCOS-IR组大鼠FBG分别与各自组0周FBG相比均增加(P<0.05)，PCOS组FBG较NC组FBG增加，但无统计学意义(P>0.05)，IR组、PCOS-IR组大鼠FBG较NC组FBG增加，有统计学意义(P<0.05)；第6周末，IR组与同龄NC组大鼠相比较，FBG增加(P<0.001)，两组差异直到第12周末灌胃结束仍存在，PCOS-IR组大鼠与同龄NC组大鼠相比FBG无统计学差异(P>0.05)，直至灌胃结束；PCOS-IR组大鼠与同龄IR组、PCOS组大鼠相比，FBG降低有统计学意义(P<0.05)，直至灌胃结束。见表2。
表2 实验中各组大鼠空腹血糖情况
组别n0 周 5周6周 7周8周9周NC组 103.13±0.334.13±0.884.03±0.204.07±0.273.88±0.353.72±0.59IR组103.29±0.305.62±1.29△*5.25±0.58**5.39±0.39*4.95±0.78*4.59±0.67*PCOS组83.31±0.545.07±0.90△4.40±0.43#4.40±0.36##4.03±0.57#4.48±0.41*PCOS-IR组 83.29±0.306.06±0.45△**3.83±0.39 ##▲3.79±0.34 ## ▲3.79±0.43##3.69±0.34 ##▲
注:与0周比较,△P <0.05; 与NC组比较,* P <0.05,** P <0.001; 与IR组比较,# P <0.05,## P <0.001; 与PCOS组比较，▲P<0.05
二甲双胍干预后，与IR组，PCOS组相比，PCOS-IR组曲线下面积AUC减低(P<0.05)。与NC组大鼠相比，IR组、PCOS组曲线下面积均增加，但仅IR组曲线下面积增加有统计学意义(P<0.05)，即出现了一定程度的糖耐量降低。见表3。
表3 实验中各组大鼠OGTT血糖情况
组别nAUCOGTT 血糖0 min30 min60 min120 minNC组1021.72±3.633.88±0.4615.77±3.887.50±0.706.70±0.35IR组1031.13±3.25*4.48±0.6822.05±2.58 *15.53±1.69**10.50±0.96**PCOS组824.36±2.474.20±0.3816.76±2.76#10.00±1.08*## 7.52±0.66 ##PCOS-IR组818.91±3.83 ##▲4.02±0.4314.82±3.44#7.90±1.75## ▲6.00±1.59##▲
注:与NC组比较,*P<0.05, **P<0.001; 与IR组比较,#P <0.05, ##P <0.001; 与PCOS组比较,▲P<0.05
2.实验中各组大鼠的性激素改变
二甲双胍干预后，与NC组相比，PCOS组、PCOS-IR组血清睾酮水平增加差异有统计学意义(P<0.05)，与IR组相比，PCOS组、PCOS-IR组黄体生成素增加(P<0.05)。PCOS组、IR组大鼠血清高分子脂联素水平均较NC组降低且差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS-IR组大鼠血清高分子脂联素水平较NC组减低，但差异不明显；PCOS-IR组大鼠血清高分子脂联素水平较IR组及PCOS组增高，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表4 实验中各组大鼠激素情况
组别n性激素睾酮(ng/dl)黄体生成素(mIU/ml)卵泡刺激素(mIU/ml)高分子脂联素(ug/L)NC组10 11.13±4.430.47±0.020.01±0.0020.15±0.16IR组10 10.35±1.110.46±0.010.01±0.0016.26±0.94**PCOS组826.99±8.37*#0.46±0.010.01±0.0015.60±0.62**PCOS-IR组836.70±9.65*#0.52±0.06#▲0.01±0.0019.59±0.34##▲▲
注:与NC组比较,* P <0.05, **P<0.001; 与IR组比较, #P <0.05, ##P <0.001; 与PCOS组比较,▲P <0.05，▲▲P <0.001
3.各组大鼠卵巢大体及HE染色形态
PCOS组、PCOS-IR组大鼠卵巢体积大，可见较多囊状卵泡。
卵巢病理学改变：NC组、IR组可见不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈现多层，多为8～9层(图2-5 A、D)，PCOS组、PCOS-IR组可见囊性扩张的卵泡，黄体及各发育阶段的卵泡相对较少，颗粒细胞成数少。见图2。
4.高分子脂联素及其受体基因表达情况
IR组、PCOS组较NC组Adiponectin基因表达均增加，但无统计学意义；PCOS-IR组较IR组、PCOS组Adiponectin基因表达有所降低(P<0.05)，PCOS-IR组卵巢AdipoR2基因的表达较PCOS组减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表5 各组大鼠卵巢组织Adiponectin及其受体mRNA表达水平
组别nAdiponectinAdipoR 1AdipoR 2NC组101.00± 0.361.00± 0.171.00± 0.05IR组101.42± 0.471.31± 0.260.95± 0.19PCOS组81.38± 0.421.26± 0.261.36± 0.40PCOS-IR组80.6± 0.29#▲1.13± 0.180.93± 0.09▲
注:与IR组比较, #P <0.05; 与PCOS 组比较,▲P <0.05
5.各组大鼠血清高分子脂联素与空腹血糖、空腹胰岛素、性激素相关性分析
血清高分子脂联素与空腹胰岛素、HOMA-IR、睾酮呈正相关(r值分别为0.739、0.676、0.703，P<0.05)。
多囊卵巢综合征是育龄妇女不孕的重要原因之一，常见的表现有多毛、肥胖、月经紊乱、不孕，多伴发一些代谢紊乱和远期并发症，如高胰岛素血症、糖尿病、血压升高、血脂谱异常、心血管疾病，甚至癌症[8-9]。关于建立PCOS动物模型方法很多，有脱氢表雄酮诱导法、雄激素诱导法、孕激素联合人绒毛膜促性腺激素诱导法及来曲唑诱导法等。这些仿动物内分泌及组织学方面的变化与临床较接近[10]，符合PCOS动物的造模要求。不同方法在诱导PCOS动物模型时，卵巢变化及性激素改变存在差异。本研究为除外外用性激素对结果的影响，采用来曲唑诱导PCOS大鼠模型。本研究结果发现，PCOS组和PCOS-IR组大鼠无明显的动情周期，即呈无排卵状态；血清睾酮、黄体生成素水平分泌增加，呈高雄激素、高黄体生成素状态，卵巢多囊样变；两组均出现的糖耐量异常，空腹胰岛素、HOMA-IR均高于NC组。以上改变说明大鼠存在胰岛素抵抗及生殖功能障碍，可以作为PCOS研究模型。
PCOS患者大多通过药物治疗，同时结合控制饮食、运动减轻体重的方法，很少进行手术治疗，故临床取材相对困难。IR在POCS的发生发展中发挥重要作用，故临床上常应用改善IR的药物，通过改善PCOS患者的糖脂代谢紊乱，进而改善患者体内激素水平达到治疗的效果，增加排卵率。本研究应用二甲双胍后PCOS-IR大鼠糖耐量异常和卵巢状态均有所改善(P<0.05)。但大鼠HOMA-IR改善不明显，可能与用药时间相对较短有关。二甲双胍并非专治PCOS的药物，只是针对存在胰岛素抵抗及糖脂代谢异常的PCOS患者可能发挥一些作用，并非对所有患者都有效。因此，进一步探索PCOS的更详细发病机制，找到治疗PCOS患者安全、有效的药物仍存在很大的挑战。
高分子脂联素是脂联素多聚体中最具生物活性的一种形式[11]，具有调节糖、脂代谢、增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用[4]。研究发现，相较总脂联素，HMW-APN与IR[3]、代谢综合征、PCOS[12]的关系更密切，HMW APN或可作为PCOS防治的潜在物质，为PCOS的病理生理机制研究提供新思路，为治疗提供新的药物靶点。一项针对PCOS青年患者研究发现[3]，体内存在胰岛素抵抗的PCOS患者血清HMW APN明显减少，且HMW APN与胰岛素抵抗呈负相关。血清HMW APN水平降低可能是PCOS患者体内胰岛素抵抗和代谢异常的一个决定因素。Wickham等[13]将PCOS患者分为正常雄激素组和高雄激素组进行对比发现，相较正常雄激素组，高雄激素组患者血清 HMW-APN 明显减少，胰岛素抵抗也明显增加。故在PCOS患者体内HMW APN与IR呈负相关，与胰岛素敏感性呈正相关[13-14]。本研究发现PCOS组、IR组大鼠血清高分子脂联素水平均较NC组降低(P<0.001)；PCOS-IR组大鼠血清高分子脂联素水平较PCOS组增加(P<0.001)；同时PCOS-IR组高分子脂联素基因表达较IR组、PCOS组降低(P<0.05)；IR组、PCOS组高分子脂联素基因表达较NC组增加，但差异不明显，可能是由于IR组、PCOS组大鼠糖代谢、性激素紊乱导致血清高分子脂联素分泌减少，机体代偿性使其基因表达增加。也可能由于二甲双胍用药时间相对较短，这种差异未完全表现出，说明二甲双胍可以通过影响PCOS-IR大鼠的高分子脂联素基因表达，改善胰岛素抵抗的同时改善PCOS的症状。
综上，血清高分子脂联素在胰岛素抵抗大鼠、PCOS大鼠中表达均减少。二甲双胍可以调节糖代谢水平，减轻PCOS大鼠卵巢多囊性改变，增加HMW APN水平，从而达到改善PCOS的目的。下一步需要对二甲双胍是通过何种机制影响高分子脂联素水平来达到改善PCOS的目的进行深入研究。
(图2见封底)
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