·综述·
神经管缺陷(neural tube defects，NTDs)是常见的先天性中枢神经系统缺陷，病因复杂，致病机制不清楚。重金属暴露、高热、高糖、必需营养素的缺乏等显著增加NTDs发生风险，氧化应激损伤、内质网应激、caspase 8依赖性细胞凋亡及细胞自噬等与NTDs发生有关。未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)是一种早期的针对外界环境因素的应激反应，外界环境刺激加剧以及时间延长，UPR会失去作用并启动细胞自噬、凋亡导致神经系统异常。本综述试图从UPR信号通路的角度来探讨外环境暴露导致NTDs发生的作用机制。
NTDs是胚胎发育早期神经管闭合不全引起的一组严重先天缺陷，包括无脑、脊柱裂和脑膨出等常见亚型。全球NTDs平均患病率为1‰，高发地区为4‰～10‰[1-2]，是继先天性心脏病之后最主要的先天缺陷类型。NTDs病因复杂，是基因、环境以及基因和环境交互作用共同作用的结果，致病机制仍然不清楚。我国是神经管缺陷高发国家之一。20世纪90年代的研究表明围孕期增补叶酸可显著降低NTDs发生[3]，2009年免费叶酸增补计划在全国农村开展[4]，在北方出生缺陷高发的部分县以人群为基础的出生缺陷监测结果显示全面增补叶酸后NTDs患病率显著下降，2004—2014年间从12‰下降到3.2‰，但是仍旧远远高于美国等发达国家[2]。NTDs是导致早期流产、死胎死产的重要原因，存活者往往伴有先天残疾，给家庭和社会造成严重的心理和经济负担，成为影响我国出生人口素质的主要原因之一。加强NTDs病因和致病机制研究将为预防和减少出生缺陷、提高出生人口质量提供重要线索。
蛋白质的功能主要取决于其空间结构，而蛋白质的结构是多肽链折叠的结果，折叠过程发生错误将会导致蛋白质结构异常。UPR是细胞应对蛋白折叠错误的一系列信号传递过程，最终导致蛋白质生成减慢、非折叠蛋白被降解、蛋白质折叠功能加强等。细胞应激涉及线粒体、内质网和细胞核的应激。UPR的生理后果由基因表达改变所介导[5]。UPR作为一条综合的细胞内信号通路，已有研究报道较多的有线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response，UPRmt)和内质网未折叠蛋白反应(endoplasmic reticulum unfolded protein response，UPRer)。
线粒体是细胞内重要的细胞器，参与细胞内的多种信号通路，如细胞凋亡、干扰素信号通路等[6]。UPRmt是指在各种应激条件下，线粒体基质积累大量未折叠、错误折叠以及无效蛋白质，导致核编码靶向线粒体分子伴侣蛋白以及蛋白水解酶表达上调，如热休克蛋白(heat shock protein,Hsp:Hsp70、Hsp60、Hsp10)、YME1样ATP酶和线粒体Lon蛋白酶样蛋白等；其中伴侣蛋白帮助发生错误折叠蛋白恢复正常构象以及新合成蛋白正确折叠，蛋白酶降解无用蛋白；这种由线粒体至核的逆行信号传导过程即为UPRmt [7-8]。研究者最早通过超表达线粒体基质定位的末端错误折叠的鸟苷酸转氨甲酰酶证明UPRmt的存在[9]。近年来的研究发现功能受损的线粒体主要通过线粒体自噬途径降解，以此来维持细胞内线粒体网络的稳态。值得注意的是，能够诱导线粒体未折叠蛋白反应的刺激也最终能够诱导线粒体自噬的发生，如线粒体DNA缺失、线粒体电子转移链复合物突变、线粒体内积累大量错误折叠的蛋白质等应激信号首先激活UPRmt，若UPRmt不足以改善线粒体应激，则这种功能受损的线粒体经过线粒体自噬的途径降解，由此引起进一步的线粒体损伤导致细胞发生程序性凋亡。
内质网(endoplasmic reticulurn，ER)是真核细胞内蛋白质合成、脂质生成和钙离子贮存的细胞器，分泌蛋白和膜蛋白需要在内质网中折叠、组装、加工、包装及向高尔基体转运。细胞受到内外因素的刺激时，内质网形态、功能的平衡状态受到破坏后发生分子生化的改变，蛋白质加工运输受阻，内质网内累积大量未折叠或错误折叠的蛋白质，造成内质网应激。内质网应激发生后，细胞会采取相应的应答措施，内质网向细胞质和细胞核传输一系列错综复杂的信号，通过减少蛋白质合成，促进蛋白质降解，增加帮助蛋白质折叠的分子伴侣等方式缓解内质网压力、弥补外源性损伤和维持细胞稳态，促进内质网正常功能的恢复，这种现象被称为UPRer [10]。内质网应激和炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等共同作用导致疾病。引发内质网应激的因素很多，缺血低氧、葡萄糖或营养物匮乏、钙离子紊乱等可造成急性应激损伤；而病毒感染、分子伴侣或其底物的基因突变等能引发慢性应激损伤。内质网应激不仅能激活死亡受体，当激活效应超过降解效应时，细胞会启动死亡程序，也与炎症反应、胰岛素合成分泌有密切联系[10]。UPRer主要包括蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase receptor-like ER kinase，PERK)、肌醇需求酶-1α(inositol requiring enzyme 1α，IRE 1α)和活性转录因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)三类重要分子[11]。
重金属暴露、高热、高糖、必需营养素的缺乏、高同型半胱氨酸血症、PI3K/Akt/GSK-3β通路基因突变等显著增加NTDs发生风险；NTDs发生与氧化应激损伤、内质网应激、caspase 8依赖性细胞凋亡及细胞自噬等通路有关，UPRmt和UPRer可能在NTDs发生中有重要作用，机制有待继续研究。
1.重金属
近年来研究发现UPRmt在神经系统疾病的发生中发挥重要作用[12]。作为细胞对外界刺激早期产生的一种应答反应，环境污染物暴露可诱发UPRmt激活。重金属锰通过血脑屏障或嗅神经后直接作用于神经元，使得神经细胞内发生蛋白折叠错误以及新合成蛋白不能折叠等情况，UPRmt信号通路被激活，热休克蛋白(heat shock proteins，HSP；包括Hsp10/Hsp27/Hsp60/Hsp70等)表达增加，促进错误折叠蛋白和损伤蛋白的清除；锰过量或长时间暴露后，UPRmt信号通路被抑制，线粒体功能障碍，发生线粒体自噬甚至细胞凋亡和坏死，产生神经毒性效应。污染物通过诱导线粒体锰超氧化物歧化酶(manganese-dependent superoxide dismutase，MnSOD) 基因表达，使线粒体基质内的活性氧堆积，损伤线粒体内蛋白质，诱发UPRmt。药物三氧化二砷特异性干扰线粒体内膜转位酶23(TIM23) 及YME1 L1 介导的内膜转位酶(TIM17a)降解，诱发UPRmt[13]。
锰染毒SH-SY5Y细胞后，细胞活力下降，凋亡率上升，不同染毒组凋亡率呈明显的剂量反应关系，Hsp10表达(mRNA和蛋白)下降[14]，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和Beclin1表达水平明显增加，PI3K/AKT/GSK3β被抑制，细胞凋亡增加[15]。UPRmt分子伴侣Hsp60通过PINK1 / Parkin 途径发挥作用。在PINK1损失的多巴胺能神经元细胞培养，线粒体Hsp60表达下调40%。这可能是Parkin 和PINK1与Hsp60互动关闭UPRmt，此时线粒体被认为因过度受损不能恢复；如果UPRmt持续发生，Hsp60可能引起线粒体自噬[16]。锰可以通过FOXO3细胞核滞留促进了线粒体自噬[17]。
环境锰暴露对妊娠结局及后代发育有不良影响[18]。我们前期研究发现神经管缺陷组胎盘锰元素显著高于健康对照组，含量分别为131.60 ng/g(interquartile range,IQR:99.25-166.76)和101.54 ng/g(IQR：80.14-119.79)[19]。胎盘锰含量与NTDs发病风险有显著的剂量效应关系，胎盘锰含量在中位数以上水平组发生NTDs的风险为胎盘锰含量中位数以下组的4倍(OR=4.25，95% CI，1.23-14.79)，胎盘高浓度锰与NTDs发生有关，是否通过UPR及其通路，具体机制有待进一步探讨。
2.高热
Hsp作为UPRmt的分子伴侣，在高温导致的胚胎发育缺陷过程中发挥重要作用[20-21]。孕期高热与中枢神经系统畸形(包括神经管缺陷和小头畸形)有关[22]，Hsp主要影响小鼠神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖和分化[20]。研究者通过观察热休克对小鼠胚胎干细胞的影响发现，随着温度升高，HSP编码基因上调、诱导凋亡、细胞增殖的时间抑制和分化迟缓，以至于严重的热休克作用导致几乎所有的细胞消失，其余的细胞失去增殖和分化的能力；为NSCs温度依赖性效应在阐明妊娠期高温引起各种生殖问题的机制方面提供了线索。鸡胚中研究发现汞、镉、砷等暴露加速Hsp 24,70，90的合成，放线菌素D实验表明，亚砷酸盐诱导的这些蛋白质的表达是转录调控的[23]；抑制Hsp70-1和Hsp70-3的表达导致亚砷酸盐诱导的神经管缺陷的发生率增加6倍。通过显微注射具有Hsp70-1编码区组成启动子驱动表达的转基因来实现HSP功能的增加，并导致亚砷酸盐诱导的神经管缺陷的发生率降低[24]。
3.妊娠期糖尿病
高糖在体内和体外诱导神经管缺陷。动物研究表明，高血糖条件下由于活性氧的产生增强和抗氧化能力受损导致胚胎表现出高水平的氧化应激。氧化应激激活一系列促凋亡激酶信号转导中间体，导致胚胎神经管细胞异常死亡，导致NTDs形成。在啮齿动物模型中，母体糖尿病激活了凋亡前UPR[25]。凋亡信号调节激酶1 (apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)——叉头转录因子3a(forkhead transcription factor 3a，FoxO3a)——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase 8)通路的激活引起发育中的神经管细胞的凋亡，该通路抑制后可以预防糖尿病引起的出生缺陷[26]。ASK1通过激活c-Jun-N-末端激酶1/2(c-Jun-N-Terminal kinase 1/2，JNK1/2)激活UPR和ER应激。分子研究进一步表明，PRKC、ASK1、JNK1或JNK2基因的缺失消除了母亲糖尿病诱导的神经祖细胞凋亡，减少NTDs。此外，具有ED富尾的CBP/P300相互作用反式激活子(CBP/p300-interacting transactivator with ED-rich tail 2，CITED2)是胚胎发生所必需的转录辅助因子，其缺失通过增加神经干细胞凋亡引起NTDs。高糖水平时miR-200b升高、CITED2表达下调，miR-200b和CITED2在胚胎发育中的ER稳态和NTD形成中是关键的[27]。
内质网应激和caspase 8依赖性凋亡在母亲糖尿病致NTDs发生中发挥重要作用。IR1α信号体介导ER应激的促凋亡作用，糖尿病增加肿瘤坏死因子受体1R相关死亡域(tumor necrosis factor receptor type 1R-associated death domain，TRADD)的表达。体外TRAD过度表达在Caspase 3和Caspase 8裂解和凋亡前表现出UPR和ER应激。缺乏死亡效应子结构域的Fas相关蛋白与死亡域(Fas-associated protein with death domain，FADD)显性阴性(FADD-DN)突变体体内过表达破坏了糖尿病诱导的IRE1α信号体，阻断JNK1/2-ASK1通路，减轻糖尿病诱导的凋亡前Bcl-2细胞线粒体移位、线粒体功能障碍和caspase裂解，抑制了ER应激和caspase 8依赖性凋亡，从而预防NTDs[28]。
4.高同型半胱氨酸血症
高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)是一种以血浆总同型半胱氨酸水平升高为特征的临床疾病，是NTDs的高风险因素[29-30]。叶酸、维生素B6和B12是Hcy代谢中重要的膳食辅因子，这些营养素血浆水平下降与HHcy有关；发展中国家以上维生素普遍缺乏，可能是这些国家HHcy和NTDs发病率增高的原因。
HHcy会增加UPR[31]。HHcy已被证明诱导ER应激肝细胞、内皮细胞和血管平滑肌。动物实验采用小鼠脑和原代人/小鼠星形胶质细胞模型显示HHcy可以抑制自噬，并且是与增加的mTOR溶酶体信号有关。溶酶体膜蛋白LAMP2、空泡ATPase(ATP6V0A2)和蛋白酶组织蛋白酶D降低，提示溶酶体功能障碍也参与了自噬缺陷。通过补充维生素B可以恢复自噬通量，减轻ER应激，并逆转HHcy引起的溶酶体功能障碍。HHcy抑制自噬可加重缺氧缺糖再灌注和氧化应激时细胞损伤。
5.肌醇和PI3K/Akt/GSK-3β通路基因突变
补充肌醇可以预防NTDs[32-33]和妊娠期糖尿病[34]，可能与TRAD参与IRE1α信号体并诱导UPR和ER应激有关[28]。PI3K/Akt/GSK3β是细胞内重要的信号传导通路，参与细胞转录、翻译、增殖等活动，通过多种途径抑制细胞凋亡。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)激活的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、FoxO、mTOR、Par-4、P21等，从而影响细胞的增殖或凋亡。抑制糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)信号可以抗神经细胞凋亡[35-36]。动物实验提示PI3K/Akt/GSK3β通路上多个基因的变异影响神经管闭合。果蝇胚胎中PVR基因突变导致胚胎背中线闭合缺陷[37]，鸡胚中PI3K、PDGFR基因突变导致神经管发育异常[38]和脊柱裂[39]。TCTN3、SPECC1L、GRHL2、GRHL3、LAMC2、FGF19基因敲除小鼠模型细胞凋亡增加、粘附连接作用改变导致NTDs[40-43]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)通过刺激PI3K/Akt/GSK3β/β-连环素途径，促进神经细胞的生长(数目、体细胞大小和平均突起长度)和神经干细胞的增殖和分化[44]。PI3K/Akt/GSK3β通路激活可以通过直接调节谷氨酸介导的Bcl-2/Bax失衡来达到神经保护[45]；也可以通过直接或间接影响转录因子家族(FoxO、NF-κB、p53等)发挥细胞存活调控作用；增强PI3K/Akt/GSK3β信号通路，可以抑制MPP+激活JNK通路，减少细胞凋亡[46]。
未折叠蛋白反应是一种早期的针对外界环境因素的应激反应，在神经系统疾病中发挥重要作用，外界环境刺激加剧以及时间延长，UPR会失去作用并启动其他生物效应如细胞自噬、凋亡等。氧化应激损伤、内质网应激、caspase 8依赖性细胞凋亡及细胞自噬等通路与NTDs发生有关。但是仍旧有些问题不明确：不同应激条件下，启动不同信号通路致畸的关键因素是什么？NTDs发生中蛋白合成异常与UPR的关系如何？UPR启动及发挥作用的关键标志物和时点如何测量？从UPR信号通路的角度来探讨外环境暴露导致NTDs发生的作用机制，对于寻找NTDs早期生物标志物及干预靶点具有重要意义。
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