妊娠期是妇女的特殊生理时期，随着妊娠进展，母亲体内红细胞大量合成，子宫和胎盘生长，胎儿生长和器官形成，这一系列过程伴随着广泛且持续的细胞分裂，而叶酸对于核苷酸的合成有重要作用[1-2]。妊娠期，妇女对叶酸的需求增加，而膳食叶酸摄入往往不能满足叶酸的需要量，易引起妊娠期妇女体内叶酸缺乏。多项研究发现，孕期叶酸缺乏与多种不良妊娠结局和妊娠并发症有关[1-3]，围孕期补充叶酸能够降低神经管畸形、唇腭裂和某些先天性心脏病的发生风险[4-5]。血浆或血清叶酸和红细胞叶酸浓度是评价人体内叶酸水平的主要指标，其中血浆或血清中的叶酸水平容易受到3周内膳食等因素的影响，红细胞叶酸水平反映了人体内组织叶酸的储量，能稳定保持3～4个月[6-7]。本研究旨在了解山西省部分地区妇女的血液叶酸水平及其可能存在的影响因素。
对象与方法
一、对象
本研究依托于北京大学生育健康研究所在山西、河北等北方地区开展的重大出生缺陷病因研究项目。该研究采用病例对照探讨出生缺陷的各种危险因素，每调查2名病例，要选择1名孕龄相差不大于1个月的同期B超检查无任何异常的胎儿(或婴儿)的母亲作为健康对照。在妇女孕中期体检时知情同意后，采集问卷信息和血液标本。本次研究的人群对象来源于山西省平定、寿阳、太谷、泽州等项目县，选取自2013年至2017年间募集到的与出生缺陷病例配对的正常对照孕期妇女，排除血浆标本缺失7例，研究最终纳入234名孕期妇女。
二、方法
1.问卷调查：在征得研究对象的知情同意后，由经过培训的医护人员使用问卷调查表进行面对面调查，调查内容包括孕妇一般情况、膳食习惯、叶酸增补剂服用情况、末次月经日期、孕产史等。叶酸增补剂服用情况包括妇女开始服用叶酸的时间，服用叶酸的频率，坚持服用叶酸的天数等。膳食习惯主要包括怀孕前3个月到怀孕后3个月内妇女每周摄入新鲜蔬菜、新鲜水果的频率。
2.血标本采集和叶酸浓度测定：采集妇女的肘静脉血4 ml于紫帽真空采血管中，颠倒混匀后取100 μl抗凝血于1 ml浓度为10 g/L的抗坏血酸溶液中制备成溶血液，剩余抗凝血离心分离出血浆和血细胞，-80℃冰箱保存，直至测定。采用微生物法测定血浆叶酸和全血溶血液叶酸浓度。参照美国CDC微生物法测定叶酸的标准试验操作规程，研究对象的血细胞比容无法得到的情况下可以假定研究对象的血细胞比容为40%，用以计算红细胞叶酸浓度[8]。由于血浆叶酸浓度和红细胞叶酸浓度呈偏态分布，因此采用中位数和第25～75百分位间距(P25，P75)表示研究对象叶酸浓度的平均水平。
血浆叶酸采用<10.5 nmol/L作为判定缺乏的界值[9]；红细胞叶酸缺乏采用<363.0 nmol/L判定界值[10]，妇女孕早期红细胞叶酸浓度≥ 906.0 nmol/L时，胎儿神经管畸形的危险性最低[11]，计算红细胞叶酸浓度低于这一界值的妇女的百分比。妇女规范服用叶酸定义为孕前3个月至孕早期3个月连续服用叶酸[12]，有效服用叶酸为孕前即开始服用且服用时间至少1个月[13]。
3.统计学处理：数据分析应用SPSS 20.0统计软件。将血浆和红细胞叶酸浓度自然对数转换后作为因变量，妇女年龄(连续变量)、文化程度(初中及以下或高中及以上)、职业(农民或非农民)、孕周(连续变量)、孕次(1次或2次以上)、体质指数[Body Mass Index，BMI=体重(kg)/身高(m2)]、摄入新鲜蔬菜和水果频率(每周多于4次或每周不足4次)以及围孕期是否服用叶酸增补剂作为可能影响血液叶酸水平的因素，采用多元线性回归方法筛选血浆叶酸浓度和红细胞叶酸浓度的影响因素。
结 果
一、一般情况
本研究的妊娠期妇女99.6%(232/233)为汉族；平均年龄(28.1±4.9)岁；平均BMI为(23.0±3.4)kg/m2；平均孕周为(23.0±8.2)周，孕中期的妇女占77.0%(171/222)，23.0%(51/222)的妇女为孕晚期；45.3%(105/232)为初中及以下文化程度，高中占21.1%(49/232)，大专及以上占33.6%(78/232)；35.6%(83/233)为首次妊娠，48.5%(113/233)为第二次妊娠，妊娠3次及以上的占15.9%(37/233)；职业为农民的占42.0%(97/231)；90.1%(209/232)的妇女服用含叶酸的增补剂。
二、血液叶酸浓度
本研究妇女的平均全血叶酸浓度为399.1(250.0, 590.1)nmol/L；平均血浆叶酸浓度为16.8(10.4, 36.1)nmol/L；平均红细胞叶酸浓度为964.3(604.9, 1 433.0)nmol/L。血浆叶酸缺乏率为25.6%(60/234)，红细胞叶酸缺乏率为8.5%(18/212)，47.6%(101/212)的妊娠期妇女红细胞叶酸浓度低于906.0 nmol/L。规范服用叶酸增补剂的妇女有2.6%(6/234)，有效服用叶酸增补剂的妇女有20.9%(49/234)。
三、影响血液叶酸浓度的因素
年龄与血浆和红细胞叶酸浓度存在正相关；孕周与血浆和红细胞叶酸浓度均存在负相关；首次怀孕的妇女红细胞叶酸浓度高于非首次怀孕的妇女；服用叶酸增补剂的妇女红细胞叶酸浓度高于不服用者，但血浆叶酸浓度无显著差异；每周摄入水果超过4次的妇女红细胞叶酸浓度高于摄入水果少于4次的妇女。见表1。
四、围孕期增补叶酸对于血液叶酸浓度的影响
孕期服用叶酸增补剂是血液叶酸水平的重要影响因素，未服用叶酸增补剂的妇女中，血浆叶酸缺乏率为52.2%(12/23)，服用者中缺乏率为22.5%(47/209)，二者之间的差异有统计学意义。未服用叶酸增补剂的妇女中，红细胞叶酸缺乏率为25.0%(4/16)，服用者中缺乏率为7.2%(14/195)，二者之间的差异有统计学意义。对叶酸增补剂的服用情况对血液叶酸水平的影响进行单因素分析，结果显示，总服用叶酸的时间显著影响血浆和红细胞叶酸水平，见表2、表3。
将总计服用叶酸时间分组引入多元线性回归模型，调整年龄、文化程度、职业、孕周、孕次、孕前BMI、新鲜蔬菜和水果的摄入频率等混杂因素后，服用叶酸超过60 d的妇女其红细胞叶酸浓度显著高于未服用叶酸的妇女。见表4。
表1 妊娠期妇女血浆和红细胞叶酸浓度的影响因素分析
Table 1 Multiple linear regression model on blood folate concentrations and associated factors among pregnant women
Factors (Reference group)Plasma folate concentrationβ (95% CI)PRed cell folate concentrationβ (95% CI)PAge 0.042(0.019～0.066)<0.001 0.023(0.003～0.043)0.022Education(Junior high or lower) 0.11(-0.1～0.319) 0.304-0.021(-0.2～0.157)0.813Occupation(Farmer) 0.12(-0.088～0.329)0.257 0.121(-0.057～0.298)0.181Gravidity(primigravidity)-0.073(-0.31～0.164)0.544-0.291(-0.498～0.084)0.006Gestational weeks-0.045(-0.057～0.032)<0.001-0.024(-0.036～0.013)<0.001Pre-pregnancy BMI(≤25 kg/m2) 0.086(-0.132～0.305)0.437 0.159(-0.027～0.346)0.094Periconceptional folic acid use(No) 0.257(-0.076～0.59)0.130 0.412(0.086～0.738)0.013Vegetables(<4 times/week)-0.034(-0.422～0.353)0.861-0.051(-0.373～0.27)0.754Fruits(<4 times/week) 0.142(-0.267～0.551)0.493 0.37(0.029～0.711)0.033
表2 妇女服用不同叶酸增补剂的血浆叶酸浓度(nmol/L)及缺乏率(%)
Table 2 Plasma folate concentrations(nmol/L) and deficiency rate(%) by different folic acid supplementation behaviors among pregnant women
Folic acid supplementationN(%) IQR(P25, P75)<10.5(nmol/L(%)PaPericonceptional folic acid use Yes209(90.1)19.0(10.8, 37.6)22.50.002 No23(9.9)10.2(4.3, 15.3)52.2Timing of supplementation Before LMPb49(23.7)19.6(10.8, 33.6)20.40.899 Within1 month after LMP54(26.1)25.2(10.6, 43)24.1 1 month after LMP104(50.2)16.3(10.8, 36.6)23.1Supplementation frequency 5～7 days/10 days35(17.2)11.9(9.6, 38.4)34.30.071 ≥ 8 days/10 days168(82.8)20.2(11.1, 37.6)20.2Total days of supplementation(d) 30≤～<6039(19.2)11.5(8.6, 20.6)41.00.006 60≤～<9073(36.0)17.7(10.8, 37.3)21.9 ≥9091(44.8)27.9(11.6, 44.5)15.4
aCompared deficiency rate between different folic acid supplementation behavior using Chi-square test; bLMP = Last Menstrual Period
表3 妇女服用不同叶酸增补剂的红细胞叶酸浓度(nmol/L)及缺乏率(%)
Table 3 Red cell folate concentrations(nmol/L) and deficiency rate (%) by different folic acid supplementation behaviors among pregnant women
Folic acid supplementationN(%) IQR(P25, P75)<363 nmol/L(%)PaPericonceptional folic acid use Yes195(92.4)998.6(644.7, 1449.8)7.20.035 No16(7.6)537.4(313.4, 739.8)25.0Timing of supplementation Before LMPb45(23.3)1 041.6(696.4, 1609.3)11.10.362 Within1 month after LMP53(27.5)1 173.1(827.1, 1814.2)3.8 1 month after LMP95(49.2)804.9(578.9, 1204.6)7.4Supplementation frequency 5～7 days/10 days32(16.8)955.6(543.3, 1271.6)15.60.064 ≥ 8 days/10 days158(83.2)992.5(653.3, 1461.8)5.7Total days of supplementation(d) 30≤～<6038(20.0)577.4(420.1, 1043.5)18.40.026 60≤～<9064(33.7)1 066.1(659, 1461.2)4.7 ≥9088(46.3)1 026.3(772.8, 1649.6)4.5
aCompared deficiency rate between different folic acid supplementation behavior using Chi-square test; bLMP = Last Menstrual Period
表4 叶酸服用时间对于血浆和红细胞叶酸浓度的多元线性回归分析
Table 4 Multiple linear regression model on total days of supplementation and blood folate concentrations among pregnant women
Total days of supplementation(d)Plasma folateβ(95% CI)PRed cell folateβ(95% CI)P30≤～<60-0.036(-0.411～0.339)0.8490.069(-0.275～0.414)0.69260≤～<90 0.211(-0.145～0.567)0.2430.395(0.06～0.73)0.021≥90 0.435(0.092～0.777)0.0130.585(0.264～0.906)<0.001
aAdjusted for maternal age, education, occupation, gestational weeks, gravidity, pre-pregnancy BMI, frequency of vegetables and fruits; Using no folic acid supplementation as reference group
讨 论
本研究中血浆叶酸缺乏的妇女占全部对象的25.6%，红细胞叶酸缺乏的妇女占8.5%，这一比例显著低于2006年Ren等[14]报告的山西平定县和太原市的孕早期妇女的研究结果，该研究血浆和红细胞叶酸缺乏率分别为44%和35%。本研究叶酸缺乏率的降低可能与山西部分地区育龄妇女对于增补叶酸的认识程度和依从性提高有关，本研究自报服用叶酸增补剂的妇女为90.1%，远高于Ren等[14]研究报告的14.7%；自报服用叶酸增补剂的妇女红细胞叶酸缺乏的比例为7.2%，低于Ren等[14]研究报告的19.5%；自报服用叶酸增补剂的妇女血浆叶酸缺乏的比例为22.5%，高于Ren等[14]研究报告的13.7%。由于血浆叶酸受近期内的叶酸摄入影响较大[7]，缺乏详细的叶酸增补信息，同时本研究的样本量相对较少，可能是产生这一差异的重要因素。Liu等[15]在2012—2013年对叶酸强化项目后的山西孕期妇女的血浆叶酸水平进行了评价，平均血浆叶酸浓度为33.4 nmol/L，血浆叶酸缺乏率为7.6%，血浆叶酸水平显著高于本研究。虽然本研究中妇女自报补充叶酸的比例(90.1%)高于Liu等[15]研究(84.6%)，但Liu等[15]研究中43.2%的妇女在孕前即开始补充叶酸，远高于本研究的23.7%。同时Liu等[15]研究中妇女坚持服用叶酸的平均时间高于本研究人群。总体而言，山西部分地区妇女的叶酸缺乏情况得到了改善，但该人群仍有40.6%的妇女血液叶酸浓度低于有效预防神经管畸形的理想浓度，且有76.3%的妇女从怀孕后才开始增补叶酸，错过了预防神经管畸形的最佳时机，应在孕前预防保健工作中提高妇女规范服用叶酸增补剂的比例。由于样本量和研究人群选择方法的局限性，本研究人群的叶酸水平不能代表山西省育龄妇女人群的实际叶酸水平。
叶酸增补时间是孕期妇女血液叶酸水平的重要影响因素，血浆和红细胞叶酸水平随着叶酸总服用时间的增加而增加。Liu等[15]的研究也指出，叶酸增补对于血浆叶酸水平的提高有重要作用，尽早开始服用叶酸，增加叶酸补充频率，更多的坚持服用叶酸天数与提高血浆叶酸水平密切相关。孕周也是影响妊娠期妇女叶酸水平的重要因素，本研究结果显示随着孕周的增加妇女血浆和红细胞叶酸水平逐渐降低，这一结论与郝玲等[16]的研究结论一致。这可能与妊娠期叶酸需求和代谢增加，同时血容量增大导致血液叶酸稀释有关[2]。
Drogan等[17]的研究结果指出，蔬菜、水果的摄入量与血浆叶酸和红细胞叶酸存在显著相关性。本研究中每周新鲜水果的摄入频率影响红细胞叶酸水平，但未发现新鲜蔬菜的摄入频率对叶酸水平的显著影响。由于叶酸是一种非常不稳定的维生素，在食物中的含量高度依赖于储存条件的和制备方法，它的生物利用度依赖于谷氨酸链的长度和食物基质。而叶酸增补剂和强化食物中富含叶酰单谷氨酸，其吸收率是膳食中天然叶酸的最主要成分叶酰多谷氨酸的两倍。因此，利用膳食频率调查估计叶酸摄入并不能充分反映叶酸膳食摄入的真实情况[17]。
综上所述，山西省部分地区的妊娠期妇女的血液叶酸缺乏情况得到了一定改善，但妇女血液叶酸浓度仍不理想，叶酸规范服用的科学性和依从性尚有待提高。叶酸增补剂的服用时间、孕周、水果摄入频率是影响妊娠期妇女叶酸水平的重要影响因素，妊娠期妇女应规范服用叶酸增补剂，提高水果摄入频率等。
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