流行病学研究发现，妊娠期暴露于含镉(Cd)环境可能增加胎儿神经管缺陷(Neural Tube Defects，NTDs)的发病风险[1]，因NTDs流产的孕中期妇女全血中Pb的水平明显高于对照组[2]，暴露于As环境胎儿NTDs的发病风险会上升[3-4]。母亲摄入过量Mo不利于胚胎发育[5]，母亲头发中Ni和Mo含量与NTDs发病风险呈负相关关系[6]。出生缺陷发生率的空间分布与土壤中Zn、Se元素含量分布呈一定程度负相关关系[7]，但目前有关元素暴露与NTDs发病风险的关系并无定论。
以往研究采用母血、胎盘、头发等标本中元素含量来间接评估胎儿宫内暴露情况[2, 6, 8]。脐带是从卵黄囊和尿囊分化而来，是胎儿身体的一部分，能直接反映胎儿宫内暴露的情况[9]。在胎儿脐带组织元素暴露水平与NTDs发病风险关系的病例对照研究中，病例多数为产前诊断引产的患儿，对照多为足月的健康新生儿，病例组与对照组的孕龄差异很大。如果不清楚孕龄与脐带元素含量的关系就无法得到可靠的研究结论。查阅相关的国内外文献，尚未发现有关人类胎龄与脐带组织元素水平关系的研究，本研究利用不同胎龄神经管缺陷儿脐带组织元素暴露水平探究胎龄与脐带组织元素水平的关系，为后续分析奠定基础。
对象与方法
一、对象
研究对象来自山西省太谷县、平定县、昔阳县、寿阳县、泽州县、太原市和长治市2004年至2016年间，由产前超声确诊后引产或出生时发现的神经管缺陷儿，共166名，均为单胎，胎龄16～44周，中位值28.4周，胎龄四分位间距(23，34)周。研究方案通过北京大学生物医学伦理委员会的审查批准，募集时母亲签署了知情同意书。
二、方法
1.问卷调查：确诊病例后由经过统一培训的医护人员对孕妇进行面对面访谈调查，内容包括分娩年龄、孕前体重指数(BMI)、职业、文化程度、孕次、畸形儿生育史、孕期高热或感冒病史、主动或被动吸烟情况、是否饮白酒等信息。
2.标本采集与元素分析：胎儿娩出后，采集5～10 cm脐带组织存放在-20 ℃冰箱中备用。在冷冻状态下分离2 g左右的脐带，用干净剪刀将脐带血管剪开，用超纯水冲净其中的血凝块，放入干净聚乙烯自封袋中存放在-20℃冰箱中备用。将于-80 ℃冰箱里预冷至少24 h以上的脐带样品，置于预热1 h的CHRIST真空冷冻干燥机中冻干。称量冻干后样品，并比较冻干前后样品重量，计算脐带组织含水率(脐带组织平均含水率约为90%)。
准确称取0.2 g左右(d=0.001 mg，SARTORIUS公司，CP225D型)冻干脐带组织放入石英消解管中，加入3.0 ml硝酸溶液(UP级，苏州品瑞化学有限公司)，放置1 h。加入0.5 ml双氧水(UP级，苏州品瑞化学有限公司)，并用超纯水(电阻率≥18.2兆欧)定容至15 ml，加盖。放入Ultra WAVE(意大利Milestone公司)微波消解仪中，加压40 bar，处理1 h。同步制备空白样。用超纯水将消化液稀释2倍后，使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS，美国Agilent公司，7700x型)检测。每批次同步处理并检测2份标准物质 [ 猪肝(GBW 10051)] 作为质控。
3.仪器检出限：硒(Se)为0.06 ng/ml，钴(Co)为0.0019 ng/ml，镉(Cd)为0.006 ng/ml，砷(As)为0.016 ng/ml，铅(Pb)为0.0172 ng/ml，镍(Ni)为0.0225 ng/ml，钼(Mo)为0.0283 ng/ml，锌(Zn)为0.4044 ng/ml，锰(Mn)为0.0235 ng/ml。
4.统计学处理：元素含量采用中位值及四分位间距 [ M(P25，P75)] 表示，采用Kruskal-Wallis检验比较不同胎龄组元素含量。对于不同胎龄组含量有差异的Zn、Mn、Mo、Ni四种元素，将各元素含量均四等分，由小到大分别赋值为1、2、3、4，分别采用有序多分类Logistic回归模型调整潜在混杂因素后，分析胎龄与元素含量的关系。混杂因素包括母亲年龄、文化程度、职业、孕前BMI、孕次、孕早期高热或感冒史、出生缺陷生育史、主动或被动吸烟和饮白酒情况。应用SPSS 20.0软件进行数据分析。检验水准α= 0.05(双侧)。
结 果
一、胎儿及其母亲的主要特征
胎儿及其母亲的主要特征见表1。母亲年龄的中位值为26岁，四分位间距(23，31)岁。77.7%的母亲为农民，83.4%的母亲文化程度为初中或更低。孕前超重或肥胖人数占53.4%。胎儿胎龄中位值28.4周，四分位间距(23, 34)周。
表1 胎儿及其母亲的主要特征
Table 1 Characteristics of fetuses and their mothers
CharacteristicsN(%)Maternal age(years) a 17≤～<2557(35.2) 25≤～<3046(28.4) 30≤～<4559(36.4)Maternal occupation Farmer129(77.7) Non-farmer37(22.3)Maternal educationa Junior high and below136(83.4) High school and above27(16.6)Maternal pre-pregnancy BMI(kg/m2)a 16.2≤～<24.075(46.6) 24.0≤～<28.062(38.5) 28.0≤～<33.724(14.9)Maternal gravidity a 162(37.6) 263(38.2) ≥340(24.2)Whether the mother gave birth to a child with birth defecta Yes9(5.5) No156(94.5)Maternal fever or flu during early pregnancy a Yes59(36.6) No102(63.4)Maternal active or passive smoking a Yes134(85.4) No23(14.6)Maternal liquor drinking a Yes17(10.4) No146(89.6)Gestational age(weeks) 16≤～<2338(22.9) 23≤～<2848(28.9) 28≤～<3330(18.1) 33≤～<3824(14.5) 38≤～<4526(15.7)Neural tube defect subtypes Anencephaly51(30.7) Spina bifida98(59.0) Encephalocele17(10.2)
a:There is missing data for the variable.
二、不同胎龄儿脐带组织中九种元素含量比较
在五个胎龄组中，脐带组织中Ni、Mo、Zn、Mn含量的中位值及四分位间距分别为28.99 (20.10，49.76) ng/g、26.52 (21.75，33.11) ng/g、52.69 (44.79，61.78) μg/g、0.42 (0.33，0.55) μg/g，且差异有统计学意义。两两比较发现，Ni在38≤胎龄<45周组的中位值比其他四个胎龄组均低(调整P值后，P<0.05)；Mo在38≤胎龄<45周组的中位值比16≤胎龄<23周的中位值均高(调整P值后，P<0.05)；调整P值后，Zn浓度在不同胎龄组两两比较无统计学意义(P>0.05)；Mn在16≤胎龄<23周组的中位值比23≤胎龄<28周、28≤胎龄<33周、33≤胎龄<38周的中位值高(调整P值后，P<0.05)。脐带组织中Se、Co、Cd、As、Pb含量的中位值及四分位间距分别为0.56 (0.50，0.64) μg/g、3.47 (2.48，5.14) ng/g、1.33 (0.57，3.51) ng/g、6.33(3.96，9.47)ng/g和27.32(18.37，50.34)ng/g，不同胎龄组间差异未见统计学意义。见表2。
三、胎龄与脐带组织中Ni、Mo、Zn和Mn元素含量的关系
采用有序多分类Logistic回归模型调整混杂因素后，以16≤胎龄<23周组为参照，Ni在38≤胎龄<45周组含量较其他胎龄组低，Mo在28≤胎龄<33周和38≤胎龄<45周组含量较其他胎龄组高，Zn在23≤胎龄<28周和33≤胎龄<38周含量较其他胎龄组低，Mn在23≤胎龄<28周、28≤胎龄<33周、33≤胎龄<38周组含量较其他胎龄组低。见表3。
讨 论
本研究发现以16≤胎龄<23周为参照，Ni在38≤胎龄<45周含量降低，Mo在28≤胎龄<33周和38≤胎龄<45周含量升高，Zn在23≤胎龄<28周和33≤胎龄<38周含量降低，Mn在23≤胎龄<28周、28≤胎龄<33周、33≤胎龄<38周含量降低。未发现脐带组织中Se、Co、Cd、As、Pb元素含量与胎龄相关。
有关脐带组织中元素含量的研究较少。本研究检索了国内外文献，仅找到两篇有关足月新生儿脐带组织中元素含量的研究(见表4)。两个研究均采用与本研究相同的ICP-MS检测方法。日本的研究检测的是48名健康足月儿(37～41周)的冻干脐带Se、Cd、Pb、Zn元素含量[10]，结果与本研究接近。另外一个是英国的父母和儿童队列研究(The Avon Longitudinal Study of Parents and Children, ALSPAC)[11]，该研究测定的是湿重脐带组织中的Se、Pb、Zn元素含量，报告的是几何均数。本研究中Se、 Pb、Zn含量几何均数分别为551.87 ng/g、28.59 ng/g、56 697.26 ng/g，与英国的研究差异悬殊，即使考虑了脐带组织的含水率后(约为90%)，本研究的结果仍明显高于该研究。
表2 不同胎龄的脐带组织中九种元素含量
Table 2 The concentrations of nine elements in umbilical cord tissue by different gestational age group
ElementsaAll (N=166)Gestational age group (weeks)16≤～<23(N=38)23≤～<28(N=48)28≤～<33(N=30)33≤～<38(N=24)38≤～<45(N=26)P-valuesNi (ng/g)28.99(20.10, 49.76)36.04(25.78, 58.38)31.16(21.05, 72.98)29.28(21.56, 45.63)34.74(21.24, 42.94)17.19(12.73, 24.70)0.00∗Mo (ng/g)26.52(21.75, 33.11)25.20(18.13, 27.34)25.66(20.29, 32.41)26.72(22.51, 31.39)29.48(19.14, 34.24)32.72(25.45, 36.76)0.01∗Zn (μg/g)52.69(44.79, 61.78)55.37(45.43, 74.59)46.89(41.55, 61.78)51.47(45.67, 57.49)47.5(38.75, 58.80)56.96(50.83, 64.25)0.03∗Mn (μg/g)0.42(0.33, 0.55)0.54(0.42, 0.63)0.39(0.30, 0.50)0.40(0.32, 0.53)0.34(0.32, 0.42)0.51(0.35, 0.77)0.00∗Se (μg/g)0.56(0.50, 0.64)0.60(0.50, 0.66)0.58(0.49, 0.64)0.54(0.47, 0.59)0.57(0.52, 0.66)0.56(0.48, 0.64)0.22Co (ng/g)3.47(2.48, 5.14)3.46(2.14, 4.47)3.42(2.20, 4.54)3.14(2.44, 4.95)4.26(3.14, 7.72)3.67(3.03, 7.51)0.08Cd (ng/g)1.33(0.57, 3.51)1.25(0.67, 2.63)1.30(0.50, 2.53)1.08(0.60, 4.95)3.00(1.08, 5.44)0.98(0.36, 5.38)0.10As (ng/g)6.33(3.96, 9.47)7.70(5.03, 10.36)6.22(4.44, 9.02)6.41(3.55, 10.43)6.10(1.81, 8.52)5.78(3.68, 7.58)0.28Pb (ng/g)27.32(18.37, 50.34)27.65(22.22, 50.34)27.42(15.16, 41.86)27.15(17.53, 51.08)31.65(20.36, 59.50)25.91(16.82, 55.92)0.58
Kruskal-Wallis test, *P<0.05
表3 脐带组织Ni、Mo、Zn和Mn元素含量与胎龄的关系
Table 3 The relationship between the concentration of Ni, Mo, Zn and Mn in umbilical cord tissue and gestational age
Elements and gestational age(weeks)UnivariatemodelOR95% CI Multivariate modelOR95% CI Ni 16≤～<231.001.00 23≤～<280.750.35-1.610.830.35-1.97 28≤～<330.620.26-1.460.700.26-1.92 33≤～<380.650.26-1.620.840.29-2.41 38≤～<450.070.03-0.21∗0.080.02-0.27∗Mo 16≤～<231.001.00 23≤～<281.480.69-3.181.530.64-3.65 28≤～<332.130.89-5.052.911.06-8.02∗ 33≤～<382.310.92-5.822.630.91-7.61 38≤～<454.341.72-10.97∗5.661.89-16.88∗Zn 16≤～<231.001.00 23≤～<280.400.18-0.87∗0.320.13-0.76∗ 28≤～<330.670.28-1.590.650.24-1.76 33≤～<380.340.13-0.86∗0.260.09-0.75∗ 38≤～<451.290.52-3.180.950.33-2.72Mn 16≤～<231.001.00 23≤～<280.200.09-0.44∗0.140.06-0.37∗ 28≤～<330.320.13-0.77∗0.280.10-0.79∗ 33≤～<380.130.05-0.35∗0.100.03-0.32∗ 38≤～<450.680.27-1.680.800.27-2.35
*P<0.05
表4 三项研究中脐带组织元素值对比
Table 4 Comparison of elemental concentrations of umbilical cord tissue in three studies
Elements(ng/g)This study (NTD fetuses, n=116) (DW)Median (P25-P75)Geometric meanStudy in Japan[10](healthy fetuses, n=48)(DW)aStudy in UK[11](healthy fetuses, n=911)(WW)bSe 565.00(497, 641)551.87 454.00(384, 528)0.0657Cd 1.33(0.57, 3.51)- 1.16(0.87, 1.68)-Pb 27.32(18.37, 50.34)28.59 39.90(33.8, 50.1)0.0270Zn52 691.00(44 791, 61 782)56 697.2635 700.00(32 000, 41 900)7.4483
a:The concentration is shown as median and interquartile range, DW:dry weight; b:The concentration is shown as geometric mean, WW:wet weight.
检索国内外文献，未见有关脐带组织元素含量与胎龄关系的研究，因此，本研究通过有关孕周和母亲血液或头发中元素含量关系的研究结果，探索其规律的一致性。母亲孕早期血清Zn含量较孕晚期高[12-13]，如在西班牙亚拉贡地区的研究检测了159名健康妊娠妇女血清中Zn元素浓度，发现血清Zn含量中位值在孕5～15周时为72.0 μg/dl， 在孕15～25周、25～35周、35～40周中位值都是60.0 μg/dl，即Zn含量在5～15周时较高[12]，这与本研究脐带组织中的Zn含量变化规律不同。上海市郊区妇女孕晚期(28周至分娩前)头发中Ni含量下降(P<0.05)[14]，与本研究中Ni元素浓度在38～44周组含量降低的结果一致。且上海市郊区妇女孕晚期(28周至分娩前)头发中Co含量也无孕周差异[14]。本研究中Mn和Zn元素浓度在16～22周和33～37周组低于38～44周，而上海市郊区妇女孕晚期(28周至分娩前)头发中Mn含量下降(P<0.05)，而Zn含量在孕晚期至分娩前无差异[14]。
鉴于缺乏母亲头发、血液、胎盘、脐带血或脐带组织相关元素含量之间的关系或上述元素与孕周关系研究的文献，尚难以通过其他研究的结果来评价本研究的发现，提示将来需要重视这方面的研究。
本研究首次采用脐带组织样本中元素含量作为胎儿体内元素水平标志物来研究胎龄与胎儿体内元素水平的关系，然而由于脐带样品来自NTDs患儿，可能与健康胎儿存在一定差异，但由于未足月健康胎儿的脐带组织难以获得，通过NTDs病例的脐带组织观察也不失为一种权宜之计。
综上所述，本研究通过对166例16～44周NTDs胎儿脐带组织分析胎龄与脐带组织九种微量元素含量的关系，发现脐带组织中Zn、Mn、Mo、Ni含量与胎龄有关，而Se、Co、Cd、As和Pb元素含量与胎龄无关。
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