据统计，中国不孕不育率约为7%～10%[1]，预测将来不孕不育率还将进一步升高。目前，辅助生殖技术已经取得了很大进展，但卵巢储备功能有待完善，卵巢储备功能降低易导致体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中卵巢反应性下降，获得的卵子少，增加临床周期取消率，而卵巢高反应会增加卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生[2-3]。目前卵巢低反应的定义尚存争议，大多定义为获卵数小于3～5个[3-4]，本研究回顾性比较不同卵巢反应性患者的一般情况及临床妊娠结局，以寻找简便、经济、有效的预测卵巢反应性及妊娠结局的指标，为治疗前评估提供参考。
资料与方法
1.研究对象：选择2009年4月至2015年12月在苏北医院生殖中心接受体外受精/卵胞浆内单精子注射-移植(IVF/ICSI-ET)治疗的不孕患者。入选标准包括长方案行体外受精(IVF)或单精子卵胞浆内注射(ICSI)的不孕患者，患者年龄20～44岁，平均年龄(29.7±4.3)岁，不孕年限0.3～21年，平均不孕年限(4.0±2.9)年，移植内膜厚度8～15 mm之间。排除标准为因家庭及身体因素未取卵者，取消周期患者包括未取卵(卵泡生长不良)、未取到卵、未受精、未授精、异常受精和无可移植胚胎周期。共计1 176名患者，1 305个取卵周期。
2. 激素测定及窦卵泡计数方法：于准备IVF/ICSI方案前的月经第2～4天取空腹血测定卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)。窦卵泡计数IVF/ICSI-ET周期前月经第2～4天，用阴道B超常规探查盆腔，记录双侧卵巢内5～10 mm的基础卵泡数，双侧之和为窦卵泡数(AFC)。
3. 促排卵方法：1 305个取卵周期均使用长方案降调节方案，即黄体中期给予皮下注射GnRH-a短效制剂[曲普瑞林，商品名：达必佳，德国辉凌制药)]0.1 mg/d×(7～14)d，随后改为皮下注射0.05 mg/d维持，或者单次使用长效曲普瑞林 [商品名：达菲林，博福-益普生(天津)]1.25 mg 皮下注射。再于月经第三天起使用促排卵药物，促排卵药物包括FSH和尿促性腺激素(HMG)[丽珠公司，75 IU]150～300 IU/d，其中FSH，有重组人促卵泡激素(rFSH)[果纳芬，瑞士默克雪兰诺公司]和尿源性促卵泡激素(uFSH)[丽申宝，丽珠医药]两类。第5天起行卵泡监测，同时监测雌二醇(E2)、LH、孕酮(P)水平，并根据卵泡大小调整Gn用量。每日行超声监测卵泡大小及数量，当有2个卵泡平均直径大于18 mm或4个卵泡平均直径大于16 mm时，测定雌激素水平，停用Gn，并于当晚注射8 000～10 000 IU hCG，36 h后在超声引导下经阴道穿刺取卵。定义获卵数小于5个为卵巢低反应，获卵数5～20个为正常反应，大于20个为高反应。所获卵细胞根据患者具体情况行IVF 或 ICSI。常规体外培养72 h，胚胎按胚胎形态及碎片多少分级，I、II级为优质胚胎。根据胚胎质量及患者具体情况，选择新鲜周期移植或冻胚周期复苏移植，移植胚胎数目为1～3个。移植后常规给予黄体酮40～80 mg肌内注射，或阴道放置黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺酮，英国Fleet Laboratories公司)90 mg/d予以黄体支持。胚胎移植后14 d早晨空腹抽血查β-hCG，阳性者于移植术后28～35 d行阴道超声检查以确定妊娠情况。如B超检查见孕囊、胚芽、原始心管搏动或手术病理检查证实为异位妊娠。宫内临床妊娠者则继续使用黄体酮支持治疗直至妊娠70～80 d，且孕期随访4次直至分娩。胚胎复苏后会再次评分，胚胎复苏结果良好行移植，移植后处理同新鲜周期移植。
4. 观察指标：获卵数、正常受精率、可移植胚胎率、优质胚胎率、早期流产率、异位妊娠率、双胎率、单胎活产率、累计妊娠率。预测卵巢反应性的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、OR比值比。
IVF正常受精率=(2PN数/获卵数)×100%；
ICSI正常受精率=(2PN数/MII数)×100%；
可移植胚胎率=(可移植胚胎数/正常受精卵裂胚胎数)×100%；
优质胚胎率=(优质胚胎数/可移植胚胎数)×100%；
累计妊娠率=(累计妊娠数/取卵周期数)×100%；
双胎活产率=(双胎活产数/临床妊娠周期数)×100%；
早期流产率 =(早期流产数/临床妊娠周期数)×100%；
异位妊娠率=(异位妊娠数/临床妊娠周期数)×100% 。
5. 统计学处理：应用SPSS19.0统计软件，满足方差齐性条件时，采用单因素方差分析；不满足方差齐性条件，则采用非参数的 Kruskal-Wallis检验；率的比较应用卡方检验；用线性回归及多重线性分析研究相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.不同卵巢反应组患者一般情况比较：三组年龄(Age)、FSH、LH、FSH/LH、AFC比较，差异均有统计学意义。不孕年限在低反应与高反应组间差异有统计学意义，BMI在低反应组与正常反应组、低反应组与高反应组间比较，差异均有统计学意义。见表1。
2.不同卵巢反应组受精和胚胎质量及临床妊娠结局的比较：IVF可移植胚胎率按低反应组、正常反应组、高反应组依次降低，三组组间差异均有统计学意义。正常受精率在低反应组与正常反应组、低反应组与高反应组间比较，差异均有统计学意义。ICSI组可移植胚胎率、优质胚胎率在高反应组与低反应组间比较，差异有统计学意义。三组间IVF优质胚胎率、ICSI正常受精率比较，差异均无统计学意义。见表2。
累计妊娠率、单胎活产率、流产率、双胎率、宫外孕率、死产率和宫内外孕率在三组间差异均无统计学意义。OHSS发生率按低反应组、正常反应组、高反应组依次升高，在低反应组与高反应组、正常反应组与高反应组之间差异有统计学意义，高反应组发生OHSS率可达11.2%。见表3。
表1 不同卵巢反应组患者一般情况比较
组别周期数取消周期数取卵周期数取消周期率(%)年龄(Age,岁)不孕年限(年)低反应组185919449.232.4±5.24.6±3.5正常反应组10373210053.129.7±5.2∗4.0±2.8高反应组21042061.928.3±3.8∗#3.7±3.0∗
组别BMI(kg /cm2)FSH(U/L)LH(U/L)FSH/LHAFC(个)GnRH-a总剂量(mg)低反应组23.1±3.18.2±3.04.2±2.12.3 ±1.19.2±4.21.7±0.4正常反应组22.1±3.0∗6.8±2.2∗4.6±2.4∗1.8±1.2∗12.0±4.1∗1.7±0.3高反应组21.9±2.6∗5.8±1.6∗#5.5±2.8∗#1.3±0.6∗#15.6±4.3∗#1.7±0.3
注：与低反应组比较，*P<0.05；与正常反应组比较，#P<0. 05
表2 不同卵巢反应组受精及胚胎质量的比较
组别IVF(n=1023)取卵周期数正常受精率(%)可移植胚胎率(%)优质胚胎率(%)ICSI(n=282)取卵周期数正常受精率(%)可移植胚胎率(%)优质胚胎率(%)低反应组750.70.90.6190.81.00.7正常反应组7860.62∗0.8∗0.52190.70.80.6高反应组1620.6∗0.7∗#0.5440.70.7∗0.5∗
注：与低反应组比较，*P<0.05；与正常反应组比较，#P<0.05
表3 不同卵巢反应组妊娠结局比较(%)
组别单胎活产率流产率双胎率宫外孕率死产率宫内外孕率OHSS率累计妊娠率低反应组31.612.012.03.4000.967.0正常反应组39.59.77.44.20.20.11.762.9高反应组40.110.67.73.400.511.2∗#68.0
注：与低反应组比较，*P<0.05；与正常反应组比较，#P<0.05
3. 各项指标对卵巢反应性预测的价值：用FSH、FSH/LH、Age、BMI预测卵巢低反应有意义,其中Age相较其他三项指标更能预测卵巢低反应性；AFC、LH预测卵巢高反应有意义，AFC较LH更能预测卵巢高反应性。曲线下面积及P值如表4、表5，各项指标ROC曲线图如图1、图2、图3。
表4 各项指标预测卵巢低反应的ROC曲线
变量曲线下面积标准误P值95%CI上限下限AFC0.2840.027<0.0001∗0.2310.336AFC<40.5480.2060.8200.1430.952FSH0.652#0.028<0.0001∗0.5980.707LH0.4290.0280.011∗0.3740.483FSH/LH(FSH<10U/L)0.635#0.032<0.0001∗0.5730.698Age0.671#0.029<0.0001∗0.6130.728BMI0.591#0.0290.002∗0.5340.648
注：*P<0.05；曲线下面积>0.5，#P<0.05
表5 各项指标预测卵巢高反应的ROC曲线
变量曲线下面积标准误P值95%CI上限下限AFC0.742#0.018<0.0001∗0.7060.777AFC>100.694#0.021<0.0001∗0.6530.735FSH0.3610.020<0.0001∗0.3220.399LH0.589#0.022<0.0001∗0.5460.632FSH/LH(FSH<10U/L)0.3370.021<0.0001∗0.2970.378Age0.3890.021<0.0001∗0.3480.430BMI0.591#0.0290.002∗0.5340.648
注：*P<0.05；曲线下面积>0.5，#P<0.05
图3 FSH/LH预测卵巢低反应的ROC曲线
AFC预测卵巢高反应性敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、OR值分别为0.78、0.60、1.96、0.37、5.35。Age预测低反应敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、OR值分别为0.73、0.52、1.53、0.51、2.98。见表6。
表6 各项指标的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、OR比值比
指标灵敏度特异度阳性似然比阴性似然比OR比值比AFC 低反应0.560.440.981.020.96 高反应0.780.601.960.375.35Age 低反应0.730.521.530.512.98 高反应0.280.520.591.380.42FSH 低反应0.610.521.270.751.69 高反应0.320.500.641.360.47FSH/LH(FSH<10 U/L) 低反应0.680.501.370.642.14 高反应0.800.120.921.590.58LH 低反应0.280.620.741.160.64 高反应0.590.501.180.821.45BMI 低反应0.600.521.260.761.66 高反应0.490.541.050.951.11
3. 各项指标与获卵数的线性相关关系：探讨单一指标与获卵数的线性相关关系，得出AFC、Age、FSH、LH、BMI、FSH/LH与获卵数存在线性关系，P<0.05。其中FSH(r=-0.249)、FSH/LH(r=-0.223)、Age(r=-0.235)、BMI(r=-0.056)与获卵数呈负相关，LH(r= 0.144)、AFC(r=0.437)与获卵数呈正相关，关联程度最大的为AFC，线性相关方程为：获卵数=4.591+0.702×AFC。
用多重线性分析联合指标与获卵数的线性相关关系，得出如下相关方程式：
获卵数=19.318+0.575×AFC-0.192×Age-0.562×FSH-0.228×BMI+0.288×LH
R=0.501，P<0.05。R值较r增大，表明关联程度较单一指标增强。各项指标之间及其与获卵数线性相关关系的标准系数见图4。
图4 各指标之间及其与获卵数线性相关关系的标准系数图
讨论
辅助生殖技术中卵巢反应性和妊娠结局的预测尚无统一的方法，临床上常用的指标有Age、AFC、E2、LH、FSH、BMI等。目前研究认为，Age、AFC、FSH都能预测卵巢反应性，但具体尚没有一致的结论 [5-6]。年龄≥35岁女性生育力下降，年龄越大临床妊娠率越低、流产率越高[7]。预测卵巢反应性，AMH相较AFC、FSH更有价值[8]，联合指标比单一指标更有预测价值[9-11]。
在本研究中，低反应组周期取消率最高，可达49.2%，与Pellicer等[2]、 Jenkins等[3]结论相似，不同卵巢反应组Age、FSH、LH、FSH/LH和AFC 均存在差异,差异有统计学意义，BMI仅在低反应组有差异。本研究结果表明，预测卵巢低反应时，AFC的ROC曲线下面积<0.5，单一预测价值不大，Age在预测卵巢低反应时，ROC曲线下面积=0.671，有一定预测价值。 FSH/LH和 BMI也能预测卵巢低反应性，但预测价值不及Age。预测卵巢高反应时，AFC的ROC曲线下面积=0.742，表明其预测高反应的能力强。
本研究分析了不同卵巢反应性的妊娠结局，结果提示高反应组OHSS发生率最高，与其他两组相比有差异，这与Sunkara等[12]研究一致。低反应组IVF受精率最高，这可能是因为将异常受精、未受精组作为取消周期未纳入，但取消周期并不影响妊娠相关比率。在三组间累计妊娠率、单胎活产率、流产率差异均无统计学意义。结果提示，获卵数多少与累计妊娠率、活产率、流产率不存在明显相关关系，表明单纯的追求获卵数个数的增多并不能改善临床妊娠结局。因此，卵巢反应性并不能很好预测妊娠结局。
本研究也分析了AFC、Age、FSH、LH、BMI等单一指标和联合指标与获卵数的关系，表明这些指标和获卵数之间存在线性关系。联合指标r值大于各项单一指标，提示其与获卵数的关联性较单一指标强，与Majumder等[13]研究相似。图4表明各项指标之间也存在线性关系，例如AFC与年龄之间相关系数-0.282，为负相关。女性35岁之后随着年龄增长，AFC开始下降[14]，这与本研究符合。
综上所述，辅助生殖促排卵过程中，AFC、Age、FSH、LH、BMI、FSH/LH六项指标相互影响，存在正相关或负相关，其中 AFC、LH能独立预测卵巢高反应，AFC预测价值较好，Age、FSH/LH、FSH、BMI均能预测卵巢低反应，Age预测价值较好。卵巢反应性不能预测妊娠结局中活产率、流产率，但卵巢低反应时周期取消率最高，卵巢高反应时OHSS发生率最高。
(图1、图2见封底)
1 谢幸,苟文丽.妇女科学.第8版.北京:人民卫生出版社,2013:398.
2 Pellicer A,Lightman A,Diamond MP,et al.Outcome of in vitro fertilization in women with lowresponse to ovarian stimulation.Fertil Steril,1987,47:812-815.
3 Jenkins JM,Davies DW,Devonport H,et al.Comparison of ‘poor’ responders with ‘good’ responders using a standard buserelin/human menopausal gonadotrophin regime for,in-vitro fertilization.Hum Reprod,1991,6:918-921.
4 Sunkara SK,Rittenberg V,Raine-Fenning N,et al.Association between the number of eggs and live birth in IVF treatment:an analysis of 400 135 treatment cycles.Hum Reprod,2011,26:1768.
5 Bancsi LF,Broekmans FJ,Eijkemans MJ,et al.Predictors of poor ovarian response in in vitro fertilization:a prospective study comparing basal markers of ovarian reserve.Fertil Steril,2002,77:328-336.
6 Mcilveen M,Skull JD,Ledger WL.Evaluation of the utility of multiple endocrine and ultrasound measures of ovarian reserve in the prediction of cycle cancellation in a high-risk IVF population.Hum Reprod,2007,22:778-785.
7 Abdalla H,Thum MY.An elevated basal FSH reflects a quantitative rather than qualitative decline of the ovarian reserve.Hum Reprod,2004,19:893-898.
8 Vembu R，Reddy NS．Serum AMH Level to Predict the Hyper Response in Women with PCOS and Non—PCOS Undergoing Controlled Ovarian Stimulation in ART.Hum Reprod,2017,10:91-94．
9 Bancsi LF，Broekmans FJ，Mol BW，et al．Performance of basal follicle stimulating hormoncin the prediction of poor ovarian response and failure to become pregnant after in vitro fertilization：a meta analysis．Fertil Steril,2003,79:1091-1100．
10 Zhen XM,Qiao J,Li R,et al.The clinical analysis of poor ovarian response in in-vitro-fertilization embryo-transfer among Chinese couples.J Assist Reprod Genet,2008,25:17-22.
11 Shahrokh Tehraninezhad E，Mehrabi F，Taati R，et al．Analysis of ovarian reserve markers(AMH，FSH，AFC)in different age strata in IVF/ICSI patients.Int J Reprod Biomed,2016,14:50l-506.
12 Sunkara SK,Rittenberg V,Raine-Fenning N,et al.Association between the number of eggs and live birth in IVF treatment:an analysis of 400 135 treatment cycles.Hum Reprod,2011,26:1768.
13 Majumder K ,Gelbaya TA ,Laing I ,et al.The use of anti-Müllerian hormone and antral follicle count to predict the potential of oocytes and embryos.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol?,2010,150:166-170.
14 Guo J,Zhang Q,Li Y,et al.Predictive value of androgens and multivariate model for poor ovarian response.Reprod Biomed Online,2014,28:723-732.