妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是临床上较为常见的妊娠期并发症，流行病学研究显示，ICP的发病率持续性维持在334～566/10万人左右，在合并有胆道系统疾病的孕产妇中，ICP可呈现出明显的高发态势[1-2]。
ICP可以影响到胎盘的氧化应激反应、促进高胆汁酸代谢，进而导致胎儿宫内急性缺氧，但其发病机制仍然缺乏可靠的临床研究。热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)等细胞炎症因子或者氧化应激诱导因子，能够在促进高胆汁酸代谢情况下的胎盘滋养细胞凋亡、增加胎盘微血管的血栓形成，影响到胎盘局部血流灌注的稳定性等，进而促进胎儿宫内急慢性缺氧，导致胎儿及母体不良妊娠结局的发生[3]。为了进一步揭示ICP患者肝功能、胎盘组织中HSP70、HIF-1α的表达变化，本研究选取本院产科确诊的ICP患者69例，探讨相关指标的表达及其与患者病情严重程度的关系，为临床上ICP患者的临床预后评估或者早期诊断提供参考。
资料与方法
1.一般资料：选取本院产科确诊的ICP患者69例作为ICP组，收治时间2015年1月—2017年1月，选取同期正常妊娠妇女60例作为对照组。ICP组，年龄24～39岁，平均(29.8±3.2)岁；孕周34～39周，平均(36.7±1.8)周；孕次(2.2±0.7)次，产次(0.8±0.5)次，依据《妇产科学》第八版中的ICP病情划分标准[4]，分为轻度和重度，其中轻度ICP患者41例，重度ICP患者28例。对照组，年龄23～39岁，平均(29.5±4.7)岁；孕周36～41周，平均(38.8±1.5)周；孕次(2.0±0.8)次，产次(0.9±0.4)次。两组的年龄、孕次、产次比较，差异均无统计学意义。
2.纳入和排除标准：纳入标准包括(1)ICP的诊断标准、病情分度参考中华医学会制定的标准[4]；(2)纳入研究对象均接受剖宫产手术；(3)本研究获得医学伦理委员会的批准及研究对象的知情同意。排除标准包括(1)合并其他病毒感染性疾病；(2)妊娠前伴有病毒性肝炎、肝肾功能疾病；(3)合并胎膜早破、妊娠糖尿病、妊娠高血压、结缔组织疾病等其他妊娠合并症。
3.肝功能指标检测：检测两组妊娠妇女的血清甘胆酸(Glycocholic acid，GC)、总胆汁酸(Total bile acid，TBA)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(Total bilirubin，TBIL)。采集患者肘部静脉血3 ml，加入抗凝剂2 ml，1 000 r/min离心(离心半径10 cm)5 min，采用生物酶联免疫吸附实验检测相关指标，CG、TBA、ALT、AST、TBIL检测试剂盒购自罗氏生物检测应用公司，配套试剂及仪器购自南京伯斯金生物科技有限公司。
4.胎盘组织HSP70、HIF-1α检测：采用石蜡切片脱蜡至水，采用离子水进行反复洗涤，加入牛奶液体封闭抗体，封闭时间为5 min，加入HSP70、HIF-1α抗体(鼠来源，ABCUM公司),37℃孵育 2 h，采用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加荧光染色标记的二抗抗体(购自abcum公司)，37℃孵育 30 min，加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，采用南京凯基生物制剂公司生产的显色剂进行显色，封片，镜下观察。
5.免疫组化结果判定：HSP70、HIF-1α蛋白的阳性着色表达于细胞浆或细胞核，呈黄色、棕黄色、褐色表达。根据着色强度，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为褐色、黑色；根据阳性细胞比例，阳性细胞数目所占比例≤10%为1分，阳性细胞所占比例11%～50%为2分，阳性细胞数51%～75%为3分，阳性细胞数所占比例>75%为4分；两种积分相乘总分<3分为阴性，总分≥3分为阳性；总分<3分，用 “-”表达；总分为3～5分，用“+”表达；总分<为6～9分，用“++”表达；总分>9分，用“+++”表达。
6.统计学处理：应用SPSS16.0统计软件，计量资料采用
进行统计描述，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验或者非参数检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。
结果
1.两组妊娠妇女肝功能相关指标比较:ICP组患者的血清GC、TBA、ALT、AST、TBIL水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义。见表1。
2.两组妊娠妇女胎盘组织中HSP70、HIF-1α蛋白表达程度比较：ICP组患者的HSP70和HIF-1α蛋白表达程度和阳性表达率均显著高于对照组，差异均有统计学意义，见表2。
3.不同病情ICP患者肝功能相关指标比较：重度ICP组患者的血清GC、TBA、ALT、AST、TBIL水平均显著高于轻度ICP组，差异均有统计学意义，见表3。
4.不同病情ICP患者胎盘组织中HSP70、HIF-1α蛋白表达程度比较：重度ICP组患者的HSP70、HIF-1α蛋白表达程度显著高于轻度ICP组，差异均有统计学意义，见表4。
表1 两组妊娠妇女肝功能相关指标比较
组别例数GC(mg/L)TBA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmol/L)ICP组6922.6±8.6∗49.8±14.9∗201.4±49.3∗183.1±33.0∗35.9±9.5∗对照组602.4±1.33.76±1.40 20.6±5.1 17.4±4.7 11.5±3.3
注：与对照组比较，*P<0.05
表2 两组妊娠妇女胎盘组织中HSP70和HIF-1α蛋白表达程度比较 [例(%)]
组别例数HSP70蛋白表达∗-++++++阳性率ICP组695(72.5)18(26.1)30(43.5)16(23.2)64(92.8)对照组6020(33.3)26(43.4)13(21.7)1(1.7)40(66.7)组别例数HIF-1α蛋白表达∗-++++++阳性率ICP组693(4.4)16(23.2)32(46.4)18(26.1)66(95.7)对照组6016(26.7)28(46.7)14(23.4)2(3.3)44(73.3)
注：两组比较，*P<0.05
表3 不同病情ICP患者肝功能相关指标比较
ICP分组例数GC(mg/L)TBA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmol/L)轻度组4118.8±6.235.9±11.0169.8±44.1152.0±31.830.1±7.6重度组2829.8±7.3∗62.8±13.5∗273.5±46.0∗230.9±29.5∗48.4±8.3∗
注：与轻度组比较，*P<0.05
表4 不同病情ICP患者胎盘组织中HSP70和HIF-1α蛋白表达程度比较 [例(%)]
ICP分组例数HSP70蛋白表达∗-++++++阳性率轻度组414(9.8)13(31.7)18(43.9)6(14.7)37(90.2)重度组281(3.6)5(17.9)12(42.9)10(35.7)27(96.4)ICP分组例数HIF-1α蛋白表达∗-++++++阳性率轻度组413(7.3)12(29.3)19(46.3)7(17.1)38(92.7)重度组2804(14.3)13(46.4)11(39.3)28(100.0)
注：两组比较，*P<0.05
讨论
ICP的发病机制较为复杂，胆道系统疾病、先天性遗传易感基因的携带等，均可能影响到孕期血清中胆汁酸水平的升高和促进ICP的发生。ICP能够在下列几个方面影响到孕产妇的临床结局[5-6]：(1)ICP增加了孕产妇妊娠晚期肝功能损伤、凝血功能障碍或者多器官功能障碍的发生风险；(2)ICP增加了胎儿宫内窘迫的发生风险，导致胎儿生长发育畸形的风险增加，胎儿宫内生长受限或者新生儿窒息的发生率也明显上升。现阶段临床上长期的随访研究发现，ICP的早期诊断水平较低，35%左右的孕产妇在诊断ICP时已合并有明显的器官功能损伤[7]。本研究通过对于HSP70、HIF-1α蛋白的表达变化，不仅能够为临床上ICP患者的诊断提供前期参考指标，而且还能够为ICP的病情严重程度的评估提供依据。
HSP70是热休克家族的重要成员，其能够在炎症反应、氧化应激反应或者自身性免疫损伤等方面发挥一定的作用。HSP70能够诱导下游炎症细胞如单核细胞或者中心粒细胞等的富集，导致患者细胞膜完整性的破坏[8]，增加细胞炎症因子对胎盘绒毛膜滋养细胞或者合体滋养层细胞的浸润，导致胎盘功能退化，影响到胎儿的供应及血流的灌注[9]。 HIF-1α是缺氧诱导因子，其表达浓度的改变是影响到缺氧再灌注损伤的启动因子，能够在加速胎盘血管内皮细胞的线粒体损伤，增加胎盘微血栓的形成方面发挥作用。HIF-1α还可以影响到肝细胞对于胆汁酸的代谢，导致胆汁酸的分解利用障碍，血清中胆汁酸水平的持续性上升可以导致孕产妇胎儿组织器官的直接损伤[10]。
CG、TBA、ALT、AST和TBIL等指标是评估ICP患者肝功能损伤程度的重要指标，相关指标的上升往往提示患者肝脏细胞膜的破坏，肝脏代偿功能的下降。本研究ICP患者血清中相关肝功能损伤指标明显上升，高于正常对照孕产妇，差异具有统计学意义。这可能与ICP患者体内高胆汁酸代谢，导致患者肝脏细胞膜的氧化性损伤，或者与胆汁酸的直接对于肝脏细胞膜的促分解作用有关。ICP患者胎盘组织中HSP70、HIF-1α蛋白表达阳性率的上升，则提示HSP70、HIF-1α可能参与到了ICP患者病情持续性进展过程中，二者的高表达能够在下列几个方面影响到ICP的母婴不良妊娠结局[11-12]：(1)HSP70的表达，影响到胎盘滋养细胞的成熟及分化，导致滤过或者营养物质交换功能的障碍；(2)HIF-1α蛋白的高表达，能够加剧下游IL-6或者IL-10等细胞炎症因子的高表达，促进其对于胎盘血管的毒性损伤作用，同时高表达的HIF-1α蛋白还可以导致自然杀伤性T淋巴细胞对于脐动脉的痉挛性损伤，引起脐动静脉血流灌注动力学的紊乱。章易琳等[13- 14]在严重母婴不良结局的ICP孕产妇的胎盘组织中检测相关蛋白的表达后发现，ICP胎盘组织中HSP70、HIF-1α蛋白等的异常表达，与胎盘功能、胎盘血管的阻力及胎儿宫内生长受限等指标均密切相关。但也有部分研究认为，HSP70、HIF-1α蛋白的表达只有在中度或者重度ICP患者中才存在差异性的表达[4]，本研究与此存在一定的不同，可能与ICP患者的胆汁酸水平的差距、肝脏代偿功能等的差异有关。另外，本研究发现在不同严重程度的ICP患者中，HSP70、HIF-1α蛋白或者CG、TBA、ALT、AST、TBIL等肝功能指标呈现出了明显的线性表达差异，病情越为严重，相关指标的表达越高，临床上可以通过评估HSP70、HIF-1α蛋白等，进而为ICP的病情评估提供参考。
本研究的创新性在于探讨了HSP70、HIF-1α蛋白等指标在胎盘组织而非血清中的异常表达，并揭示了其与患者病情严重程度的关系。综上所述,ICP患者血清CG、TBA、ALT、AST、TBIL水平及胎盘组织中HSP70、HIF-1α蛋白表达水平均显著升高，并且与病情程度密切相关。
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