近年来，不孕不育是人类面临的一个日益严重的健康问题，经流行病学调查大约有15%夫妇可能患有不孕症，需进行不孕因素的评估，其中男性不育作为唯一不孕因素的约占不孕夫妇的30%，同时合并女性因素共同导致不孕约占20%～30%[1-2]。因此，孕前对男性生育能力的评估也显得尤为重要。孕前优生遗传咨询与检查也是全国优生优育政策开展落实的重要环节。男性不育的遗传学病因中被发现频率最高的两个是染色体异常(如Klinefelter’s综合症)和Y染色体长臂无精症因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失[3]。AZF基因是在Y染色体的长臂上存在控制精子发生的基因，影响精子的生成，发生在AZF基因的缺失称为AZF微缺失，也称Y染色体微缺失。根据AZF基因上不同区域的缺失，通常将AZF微缺失分为AZFa缺失、AZFb缺失、AZFc缺失、AZFd缺失以及多种组合缺失模式[4]。本研究分析了自2016年12月至2018年4月于本院就诊的3 364例有生育需求的男性患者Y染色体微缺失结果，探讨AZF缺失的发生率、缺失类型及其与男性不育症的关系，为临床提供生育指导。
资料与方法
1.研究对象：选择2016年12月至2018年4月于江西省妇幼保健院产前诊断中心进行优生遗传咨询的男性患者2 330例，年龄22～45岁；以及优生咨询后于辅助生殖中心计划进行试管助孕的男性不育患者1 034例，年龄22～53岁，不育年限为1～14年，男性不育诊断标准采用世界卫生组织定义[5]。每位患者详细记录病史和生育史，按生育史分为已生育组和未生育组，对每位患者抽取外周血，进行AZF基因检测。同时收集患者精液，严格按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》(第5版) [5]进行精液常规分析。
2. 检测试剂：血液核酸提取试剂盒由天隆公司提供，染色体微缺失检测试剂盒(PCR荧光探针法)由上海透景生命科技有限公司提供。
3. 检测仪器：天隆NP968磁珠核酸提取仪、核酸浓度检测仪(NanoDrop)、透景SLAN-48P检测仪、琼脂糖凝胶电泳仪。
4.全血基因组DNA提取：严格按照试剂盒说明操作，静脉抽取患者2 ml的EDTA抗凝外周血，混匀后取200 μl采用自动化仪器抽提DNA，使用NanoDrop分光光度计测DNA浓度。
5. PCR扩增及荧光信号定量分析：采用两管多重PCR扩增，4个通道(FCM/VIC/ROX/Cy5)荧光检测的方法，判断AZFa (sY84,sY86)、AZFb (sY127,sY134)、AZFc (sY254,sY255) 3个区域6个序列标签位点(STS)的微缺失，同时设置两个内对照基因，即男性性别决定基因(SRY)和编码锌指蛋白基因ZFX/ZFY(见表1)。其中A组检测的位点为SRY、sY84、sY127、sY254；B组检测的位点为ZFX/ZFY、sY86、sY134、sY255。PCR反应条件设置如下(1)95℃预变性5 min；(2)95℃解链15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，38个循环；(3)72℃ 5 min后得到PCR产物，60℃收集FCM/VIC/ROX/Cy5信号，并保存相关文件。
表1 Y染色体微缺失检测位点及对应区域
荧光染料设置FCMVICROXCy5A组 检测位点SRYsY84sY127sY254 AZF区域ControlAZFaAZFbAZFcB组 检测位点ZFX/ZFYsY86sY134sY255 AZF区域ControlAZFaAZFbAZFc
6. 琼脂糖凝胶电泳：PCR产物取10 μl经4.0%琼脂糖凝胶电泳，100 V/40 min，用凝胶成像系统对DNA条带进行观察。阳性对照为AZF各区段均无缺失的正常男性，阴性对照为纯水。
7. 统计学处理：所有数据采用SPSS21.0统计学软件进行处理，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 患者生育及不育情况：在3 364例患者中，男性不育症的患者有1 291例，另外2 073例为尚不足以诊断为男性不育症或者是单纯的优生遗传咨询患者。此外根据患者是否有过生育史，将所有患者分为已生育组329例和未生育组3 035例，已生育组中患男性不育症的(获得性)有47例，未生育组中则是1 244例。
2. Y染色体微缺失情况：通过AZF基因检测，共发现33例存在Y染色体AZF基因微缺失。其中2例来自已生育组，缺失率为0.6%(2/329)；31例来自未生育组，缺失率为1.0%(31/3035)。另外，在1 291例男性不育症患者中，共发现30例存在AZF基因微缺失，缺失率为2.3%(30/1291)。对此33例异常样本进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果一致(图1)。在30例AZF缺失的男性不育症患者中发现24例为AZFc区域缺失，5例AZFb+c区域缺失，1例患者存在AZFa+b+c区域的组合缺失。见表2。
3. AZF 3个区微缺失率比较：分别对33例Y染色体微缺失的患者进行不同区域缺失发生率的比较，发现AZFc区缺失率最高，b区次之，而a区缺失率最低。见表3。
注：图中“D”代表Y6试剂盒阳性对照；“S1”代表AZFc区缺失标本；“S2”代表AZFb+AZFc缺失标本；“S3”代表AZFa+AZFb+AZFc缺失标本；“S4”代表正常男性标本；“B”代表Y6试剂盒阴性对照
图1 三种Y染色体缺失类型电泳图
表2 AZF缺失的男性不育症患者Y染色体微缺失类型及发生率 [例(%)]
微缺失类型例数占男性不育症患者比例(n=1291)AZFc2424(1.8)AZFb+c55(0.4)AZFa+b+c11(0.1)总计3030(2.3)
表3 AZF不同区域微缺失发生率比较
微缺失类型例数构成比(%)a区(sY84,sY86)12.4b区(sY127,sY134)717.1c区(sY254,sY255)3380.5
4. Y染色体微缺失与精液常规分析：在所有研究患者中，共收集了2 718例精液常规结果，其中异常结果为840例，异常率为30.9%(840/2 718)。主要表现为精子数量显著异常、精子活力显著异常、精液液化时间显著异常及其他，分别占60.1%(505/840)、25.4%(213/840)、9.0%(76/840)及5.5%(46/840)。在1 291例男性不育症患者中，精液异常有687例，主要是无精症患者218例，严重少精子症患者284例，以及其他异常185例。检出的30例Y染色体微缺失患者均为无精子症或严重少精子症患者。其中无精子症患者中有21例发生Y染色体微缺失，缺失率为9.6%(21/218)，包括AZFc区域缺失15例，AZFb+c组合缺失4例和AZFa+b+c组合缺失1例；严重少精子症患者中有9例发生Y染色体微缺失，缺失率为3.2%(9/284)，包括AZFc区域缺失8例和1例AZFb+c组合缺失。见表4。
表4 无精子和严重少精子患者Y染色体微缺失分析
男性不育患者分组例数Y缺例数缺失率(%)无精子症组218219.6严重少精子组28493.2总计502306.0
讨论
世界卫生组织将不孕症定义为夫妇婚后同居、有规律正常的性生活满1年、未避孕而未孕者[1]，1997年De Kretser研究发现仅由男性因素所引起的不育约占20%[6]。男性不育的影响因素众多，主要包括先天性生殖系统异常、内分泌紊乱、免疫反应异常及遗传学因素等，但因遗传因素引起的男性不育约占总不育因素的30%，其中15%～20%的男性不育患者表现出无精子症，以及约10%左右的患者表现出少精子症[7]。Y染色体的95%是男性特异性的区域，包含性别特异性的胚胎发育的遗传物质，如睾丸决定基因(sex determining region Y,SRY)。但是Y染色体不像常染色体具有同源体，它不会发生同源重组，其遗传物质聚集在一条染色体上，若发生缺失则出现生育问题[8]。
AZF是在Y染色体的长臂上存在控制精子发生的基因，影响精子的生成，发生在AZF基因的缺失称为AZF微缺失。有研究表明[9]，在男性中AZF微缺失的发生率为1/3 000～1/2 000，在不育的男性中，AZF微缺失的检出率为0.6%～1.0%，而在无精症和严重少精子症患者中，AZF微缺失的检出率分别为10%～15%和3%～5%。由此可见，AZF微缺失是导致生精障碍和男性不育最常见的分子遗传学病因。
AZF区域可分为4个亚区，分别是AZFa、AZFb、AZFc和AZFd，任何1个位点出现缺失，都会表现出男性无精子症或严重少精子症，导致不育。同时，AZF片段的缺失也会直接影响有丝分裂前期和精母细胞在粗线期的正常配对，造成染色体异常从而导致习惯性流产的发生[10-11]。
本研究中，共发现33例患者存在Y染色体AZF微缺失，其中已生育组有2例，缺失率为0.6%；未生育组有31例，缺失率为1.0%。由此可见，即使是有过正常生育史的健康男性，也有可能因为环境、生活习惯等不良因素而引起获得性的Y染色体微缺失。此外，在1 291例男性不育症患者中发生Y染色体AZF微缺失的患者有30例，缺失率为2.3%，与国内外报道基本相符[12-14]。在33例Y染色体微缺失中有26例患者表现为AZFc区域缺失，6例表现为AZFb+c区域缺失，以及1例为AZFa+b+c区域缺失。由此可见，本研究中AZFc微缺失最常见，出现在所有33例Y染色体微缺失患者中，其次是AZFb区域，有7例患者检出缺失，而AZFa区域缺失仅在1例患者中检出。
AZFc缺失范围广泛，从小的亚带缺失到染色体内重组，甚至是完全缺失。AZFc最主要的基因是DAZ(deleted in azoospermia)基因，该基因在生殖细胞发展的所有阶段都有表达，参与了整个精子发生的全过程。DAZ基因的缺失程度会直接影响临床表型，表现为少精、弱精或者是无精症[15]。AZFb缺失约占缺失类型的5%～15%，涉及的缺失都是大缺失，包括AZFb和AZFb+c缺失。本研究未发现AZFb的单独缺失，而AZFb+c的缺失比例较高，约为18.2%(6/33)。临床表现为生精阻滞，多停留在精母细胞阶段，可能的原因是X、Y染色体配对过程中所需基因缺失，导致减数分裂中期染色体不配对，引起生精障碍[16]。AZFa缺失较为罕见，本研究中只发现1例AZFa+b+c的组合缺失，临床表现为唯支持细胞综合征(sertoli cell-only syndrome,SCOS)，严重无精症同时伴有睾丸体积缩小[3,17]。
在1 291例男性不育患者中，有高达502例患者表现为无精子症或严重少精子症，30例患者出现Y染色体微缺失，缺失率为6.0%。其中无精子症患者218例，21例患者出现Y染色体微缺失，缺失率为9.6%，严重少精子症患者284例，9例患者出现Y染色体微缺失，缺失率为3.2%。由此可见，Y染色体微缺失是男性无精子或严重少精子导致的男性不育的重要因素。
此外有研究表明[18]，当无精症患者携带AZFa或AZFb区域缺失时，睾丸组织无精子产生，不建议通过睾丸穿刺寻找和提取精子，患者欲获取后代只能通过供精实现。而AZFc区域缺失的患者中有约50%的机会可以在睾丸组织中提取到精子[19-20]。因此，及时进行Y染色体微缺失的检测不仅对男性不育症的诊断有非常重要的意义，而且可以避免不孕症夫妇不必要的手术和药物治疗，便于按照其实际情况制定干预方案，完成患者的生育愿望。正确的孕前优生遗传咨询，早检测早诊断，将为由Y染色体微缺失导致男性不育的早治疗提供更大的可能。
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