·综述·
神经系统的发生起源于神经外胚层，由神经管和神经嵴分化而成。人胚第3周初，在脊索突和脊索的诱导下，出现了由神经外胚层构成的神经板。随着脊索的延长，神经板也逐渐延长并形成神经沟。神经沟逐渐向头、尾两端闭合成神经管，并在头、尾两端形成前神经孔和后神经孔。胚胎第25天左右，前神经孔闭合；第27天左右，后神经孔闭合，完整的神经管形成。之后神经管的前段发育为脑，后段发育为脊髓[1]。基因缺陷和/或环境因素均可能造成神经管闭合障碍，从而导致神经管畸形(neural tube defects，NTDs)[2,3]，包括无脑畸形(常伴有颅顶骨发育不全，称露脑)、脑膨出、脊柱裂等[1]，发病率为0.05%～1%，可造成孕妇流产、围产儿和婴儿死亡或终身残疾，危害极大，给患者家庭带来沉重的经济与精神负担。NTDs的发病差异可能是由不同的风险因素导致，如营养状况、肥胖、糖尿病、叶酸补充、环境毒物以及不同种群中的遗传易感性[4]。总体而言，尽管研究已经确定了许多危险因素，但这些因素在NTDs发生过程中的确切机制尚有待于进一步研究。明确NTDs发生机制，做到早期预防很重要。大量研究发现，自噬在神经管畸形发生过程中发挥着很重要的作用。
1.细胞自噬简介：自噬是真核细胞内通过一双层膜细胞器结构进行自我消化、自我清除和获得营养的复杂过程，使细胞在饥饿、氧化应激等状态下能存活下来。这一过程受到一系列自噬相关蛋白(autophagy related proteins，Atg蛋白)的调控[5-7]，可以是选择性地去除细胞中有害或不必要的物质，也可以是非选择性的[8]。自噬过程异常与神经变性[9]、癌症[10]、衰老[11]和感染[12]等疾病关系密切。
哺乳动物细胞中存在3种自噬途径：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperonr-mediated autophagy，CMA)[13,14]。巨自噬是真核细胞中通过起源于内质网的双层膜结构形成的自噬体，包被蛋白质聚集体、损伤或衰老的线粒体和过氧化物酶体等，并将其转运到溶酶体进行消化降解[15]。微自噬是溶酶体膜包裹胞质成分后内陷，进行消化降解，没有形成自噬体[16]。CMA则是依靠特定的受体与靶向基序的特异性识别，对胞质内容物进行选择性运输降解，运输过程中不形成中间囊泡或进行膜融合[6,17]。
2.细胞自噬分子机制：细胞自噬核心成分主要由4种大分子物质组成，即Unc-51样自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)复合物、III类磷脂酰肌醇3-激酶(class III phosphatidylinositol 3-kinase，PI3KIII)复合物、泛素化修饰系统及跨膜蛋白[15]。ULK1复合物由ULK1、自噬相关蛋白13(autophagy-related protein 13,Atg13)、分子量大小为200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白(FAK family interacting protein of 200 kDa，FIP200)和Atg101组成，受调控分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)调节[16,18-19]。PI3KIII 复合物由Vps34、Beclin1、Vps15、Atg14组成，通过产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3 phosphate，PI3P)来启动自噬体的形成[20]。泛素化修饰系统包括Atg5-Atg12-Atg16连接系统和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)连接系统，作用于隔离膜的延长和自噬泡的形成。跨膜蛋白Atg9可通过影响膜泡运输调控自噬[20-21]。
营养条件充足，自噬未启动时，mTORC1通过磷酸化ULK1和Atg13使ULK1复合物失活，AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)-mTORC1-ULK1信号通路下传中断，从而阻断自噬。当营养物质缺乏时，细胞内诱导磷酸酶形成，将mTORC1去磷酸化使其失活，对ULK1和Atg13磷酸化作用终止，使得ULK1和Atg13去磷酸化，促使ULK1复合物的激活[20]。激活的ULK1复合物磷酸化Beclin1和自噬/苄氯素1调节因子1(activating molecule in BECN1-regulated autophagy protein 1，Ambra1)，Ambra1促进Beclin1和Vps34的相互作用，使PI3KIII 复合物形成和活化[14,22]。此外，活化的ULK1介导PI3KIII 复合物运输至内质网(endoplasmic reticulum，ER)，其中Vps34催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)转化为PI3P，募集自噬体形成所需的特定自噬蛋白，促使杯状双层膜结构的自噬前体形成[16]。随后，自噬前体延伸包裹待降解底物，形成完全闭合的自噬泡。自噬泡通过Atg9系统运输达到溶酶体，其外膜最终与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体。最后，自噬溶酶体的内容物被溶酶体水解酶消化[16,21]。
3.细胞自噬与NTDs：自噬是一种很强的分解代谢过程，是胚胎发育过程中快速的细胞重构所必须的，可以通过环境和激素刺激诱导发生。基础水平的自噬可以降解受损的细胞器和长寿蛋白质；相反，过度活跃的自噬可能干扰细胞的生理过程，甚至导致细胞死亡，干扰正常的胚胎发生[23]。Fimia 等[8]发现哺乳动物神经系统发育需要自噬，细胞生长和细胞死亡之间复杂的相互作用。当自噬损伤积累到一定的程度将导致NTDs的发生。Wang等[24]的研究发现，通过敲除编码自噬负调控的Prkcα基因，可以逆转糖尿病诱导的细胞自噬损伤和细胞凋亡，导致NTDs减少。许多研究表明，自噬相关基因AMBRA1缺失导致大量的神经上皮细胞凋亡和NTDs的形成[13,15,22-25]。
1.AMBRA1基因结构及功能：AMBRA1基因编码Ambra1蛋白。人类AMBRA1基因位于11p11.2染色体上，包含23个外显子，编码的蛋白质分子量为142 kDa，包含1 298个氨基酸残基。小鼠Ambra1基因位于2号染色体上，包含19个外显子，编码的蛋白质分子量为143 kDa，包含1 300个氨基酸残基。Ambra1蛋白是脊椎动物细胞中一种保守的蛋白质，存在于细胞骨架、线粒体、细胞质、细胞核、溶酶体及内质网中，参与神经元发育期间自噬调控蛋白转运以及细胞生存与增殖的调控。该蛋白质在N端区有一个特征性的WD40结构域可以通过为大分子复合物的组装提供空间，介导蛋白质-蛋白质，蛋白质-肽和蛋白质-DNA之间的相互作用而参与不同的细胞功能(包括信号转导，细胞分裂和RNA加工)。这种特征可能使Ambra1在自噬的复杂相互作用网络以及自噬与其他途径之间广泛的相互作用中起到重要作用[26]。
2.AMBRA1基因与NTDs：小鼠胚胎中Ambra1缺陷会导致胚胎发育早期自噬损伤，细胞增殖过度，随后细胞凋亡增加和泛素化蛋白在神经上皮中积聚，导致严重的NTDs[8]。Ambra1缺陷导致小鼠在胚胎发育10.5天(embryonic day 10.5，E10.5)到胚胎发育13.5天(E13.5)之间出现露脑畸形和脊柱裂，胚胎发育16.5天(E16.5)胚胎致死[8]。类似地，在斑马鱼中，抑制ambra1a和ambra1b会导致严重胚胎畸形及相关的不完全发育。受精后2天(2 days post-fertilization,2dpf)，呈现广泛的中脑和后脑室脑积水，并产生异常头部和较小的眼睛。在3dpf时，表型进一步恶化，最终导致ambra1a敲除动物心脏水肿和胚胎死亡，ambra1b敲除动物在4dpf死亡[27]。因此，Ambra1在细胞自噬、凋亡、增殖过程中发挥着重要作用，是中枢神经系统发育过程中控制细胞增殖和细胞存活的必需蛋白质。AMBRA1基因突变可导致NTDs[13,15,22-23]。
在营养丰富的条件下，细胞自噬过程被抑制，mTORC1除了通过直接磷酸化ULK1对自噬进行负调控，还可以通过结合并磷酸化Ambra1抑制ULK1的泛素化，阻止ULK1的自我结合，降低ULK1的稳定性和活性，从而对自噬通路进行微调[28]。此外，在人成纤维细胞2FTGH中Ambra1还与Beclin-1和PI3KIII一起与动力蛋白复合物的动力蛋白轻链(dynein light chains，DLC)结合，阻止PI3KIII复合物移动至ER，导致自噬前体无法形成，抑制细胞自噬[26]。当营养条件缺乏，诱导细胞自噬发生时，mTORC1活性受到抑制，Ambra1激活促进ULK1的泛素化，增强了ULK1的自我结合，使其活性与稳定性进一步提高[15]。激活的ULK1又磷酸化与Beclin-1、PI3KIII和DLC结合的Ambra1，使Ambra1从动力蛋白复合物中释放，促进了Beclin-1和Vps34的相互作用，并介导PI3KIII复合物转运至ER，促进自噬体的形成，形成一正反馈调节通路[26]。
Antonioli 等[29]发现，在人成纤维细胞2FTGH的自噬反应过程中，Ambra1的稳定性还可被泛素/蛋白酶系统调节；磷酸化的Ambra1使Cullin-4与Ambra1解离，导致Cullin-4通过损伤特异性DNA 结合蛋白1(damage- specific DNA binding protein 1，DDB1)介导的Ambra1降解作用被终止；释放的Ambra1又可以通过结合ElonginB抑制Cullin-5活性，减少Cullin-5对mTOR抑制剂DEPTOR的降解而使DEPTOR含量增加，增强对mTOR活性的抑制，促进细胞自噬。
Ambra1还在线粒体自噬调节中起作用。当线粒体损伤，线粒体膜电位下降明显增加了Parkin与Ambra1的相互作用，Ambra1以Parkin依赖的方式被募集到去极化线粒体周围，激活PI3KIII复合物并促进其通过自噬途径清除[22]。此外，Ambra1-LC3相互作用可以将受损的线粒体转运到自噬体，对放大Parkin介导的线粒体清除是至关重要的[30]。
AMBRA1基因通过其编码的蛋白质调节自噬过程，自噬对胚胎神经发育至关重要。目前发现AMBRA1基因突变与神经管发育密切相关，并已经确定Ambra1可以通过很多途径对自噬进行调控，但仍有一些调节过程机制不清。随着生命科学的发展，Ambra1在神经管畸形形成过程中的作用将有可能被逐一阐明，这将有利于NTDs的防控和治疗。
1 高英茂,李和,主编.组织学与胚胎学.第2版.北京:人民卫生出版社,2010:400-413.
2 Wilde JJ,Petersen JR,Niswander L.Genetic,epigenetic,and environmental contributions to neural tube closure.Annu Rev Genet,2014,48:583-611.
3 Nikolopoulou E,Galea GL,Rolo A,et al.Neural tube closure:cellular,molecular and biomechanical mechanisms.Development,2017,144:552-566.
4 Greene ND,Copp AJ.Neural tube defects.Annu Rev Neurosci,2014,37:221-242.
5 Zhang X,Zhou Y,Xu M,et al.Autophagy is involved in the sevoflurane anesthesia-induced cognitive dysfunction of aged rats.PloS One,2016,11:e0153505.
6 Hurley JH,Young LN.Mechanisms of autophagy initiation.Annu Rev Biochem,2017,86:225-244.
7 Lu WH,Wang G,Li Y,et al.Autophagy functions on EMT in gastrulation of avian embryo.Cell Cycle,2014,13:2752-2764.
8 Fimia GM,Stoykova A,Romagnoli A,et al.Ambra1 regulates autophagy and development of the nervous system.Nature,2007,447:1121-1125.
9 Menzies FM,Fleming A,Rubinsztein DC.Compromised autophagy and neurodegenerative diseases.Nat Rev Neurosci,2015,16:345-357.
10 Galluzzi L,Pietrocola F,Bravo-San Pedro JM,et al.Autophagy in malignant transformation and cancer progression.EMBO J,2015,34:856-880.
11 Mizushima N,Komatsu M.Autophagy:renovation of cells and tissues.Cell,2011,147:728-741.
12 Gomes LC,Dikic I.Autophagy in antimicrobial immunity.Mol Cell,2014,54:224-233.
13 Fimia GM,Corazzari M,Antonioli M,et al.Ambra1 at the crossroad between autophagy and cell death.Oncogene,2013,32:3311-3318.
14 Sun WL.Ambra1 in autophagy and apoptosis:implications for cell survival and chemotherapy resistance.Oncol Lett,2016,12:367-374.
15 Cianfanelli V,De Zio D,Di Bartolomeo S,et al.Ambra1 at a glance.J Cell Sci,2015,128:2003-2008.
16 Gallagher LE,Williamson LE,Chan EY.Advances in autophagy regulatory mechanisms.Cells,2016,5:E24. doi:10.3390/cells5020024.
17 冯文之,陈扬,俞立.细胞自噬分子机制的进展.生命科学,2015,27:859-866.
18 Wong PM,Puente C,Ganley IG,et al.The ULK1 complex:sensing nutrient signals for autophagy activation.Autophagy,2013,9:124-137.
19 Zachari M,Ganley IG.The mammalian ULK1 complex and autophagy initiation.Essays Biochem,2017,61:585-596.
20 Gallagher LE,Chan EY.Early signalling events of autophagy.Essays Biochem,2013,55:1-15.
21 方梦蝶,刘波,刘伟.自噬的分子细胞机制研究进展.中国细胞生物学学报,2012,34:382-390.
22 Van Humbeeck C,Cornelissen T,Vandenberghe W.Ambra1:a Parkin-binding protein involved in mitophagy.Autophagy,2011,7:1555-1556.
23 Li X,Wu Z,Zhang Y,et al.Activation of autophagy contributes to sevoflurane-induced neurotoxicity in fetal rats.Front Mol Neurosci,2017,10:432.
24 Wang F,Xu C,Reece EA,et al.Protein kinase C-alpha suppresses autophagy and induces neural tube defects via miR-129-2 in diabetic pregnancy.Nat Commun,2017,8:15182.
25 Liu J,Chen Z,Guo J,et al.Ambra1 induces autophagy and desensitizes human prostate cancer cells to cisplatin.Biosci Rep,2017,pii:BSR20170770. doi:10.1042/BSR20170770.
26 Cianfanelli V,Nazio F,Cecconi F.Connecting autophagy:AMBRA1 and its network of regulation.Mol Cell Oncol,2015,2:e970059.
27 Skobo T,Benato F,Grumati P,et al.Zebrafish ambra1a and ambra1b knockdown impairs skeletal muscle development.PloS One,2014,9:e99210.
28 Nazio F,Strappazzon F,Antonioli M,et al.mTOR inhibits autophagy by controlling ULK1 ubiquitylation,self-association and function through AMBRA1 and TRAF6. Nat Cell Biol,2013,15:406-416.
29 Antonioli M,Albiero F,Nazio F,et al.AMBRA1 interplay with Cullin E3 ubiquitin ligases regulates autophagy dynamics.Dev Cell,2014,31:734-746.
30 Strappazzon F,Nazio F,Corrado M,et al.AMBRA1 is able to induce mitophagy via LC3 binding,regardless of PARKIN and p62/SQSTM1. Cell Death Differ,2015,22:419-432.