体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)治疗的控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是让多个卵泡同时发育成熟，体内雌激素水平在一段时间内处于超生理状态。促排卵导致的卵巢过度刺激征(ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS)，特别是重度OHSS是致命的，据统计发生率在0.5%～2%之间[1]。我院以正常妊娠母体为对照，探讨控制性超促排卵治疗后新鲜胚胎移植以及冻融胚胎移植对胎盘组织的病理学影响。
对象与方法
一、对象
本研究对象来自于2014年1月—2014年12月在青岛市妇女儿童医院产科门诊就诊的150名孕妇。其中人工助孕组100例(IVF-ET组和冻融组)，自然妊娠孕妇(正常组)50例。所有参加者均为自愿参加，填写知情同意书后，为其建立详细的病历登记资料，留存联系方式。该研究经过单位伦理委员会批准。
纳入标准：单胎初次妊娠；年龄20～35岁；血常规、生化、X线胸透和心电图检查结果均正常，夫妻双方染色体核型均正常。人工助孕组(IVF-ET组和冻融组)均要求不孕原因为单纯输卵管因素或男方因素等非免疫因素；冻融组要求自然周期妊娠；正常对照组要求妊娠前3个月未使用任何激素类药物。
排除标准：排除受孕夫妻任一方有家族遗传性疾病史及不良妊娠史者；促排卵过程中发生OHSS者；孕中晚期出现产科并发症，如妊娠期糖尿病、妊娠高血压或合并甲状腺功能异常者。
150例孕妇中，7例因后期失访被剔除，失访率为4.7%。随访过程中剔除妊娠期合并症孕妇共22例(IVF-ET组9例，冻融组9例，正常妊娠组4例)， 剩余121例数据进入统计分析阶段。其中IVF-ET组39例，冻融组40例，正常组42例。
二、研究方法
1.胎盘标本采集与处理：胎盘娩出后，在胎盘母体面底板区的中间带和中央带不同部位随机取3块组织，在 4%戊二醛固定液中切成1 mm3的组织块，经固定→脱水→渗透→包埋后用 Leica 超薄切片机切片，经醋酸双氧铀、硝酸铅双重电子染色后，在日立H-7500型透射电镜下观察及拍照。
2.终末绒毛的主要观察指标，包括：绒毛间质(绒毛水肿，纤维素沉积)以及细胞滋养层细胞(cytotrophoblast，CT)、 合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast，ST)及其亚结构(微绒毛密度、细胞浆内囊泡、核固缩、钙化及其他结构)。对所观察到的各项指标进行定量和半定量评估(表1)。每一例标本随机选取3个戊二醛固定的组织块，每一个组织块随机选取5个观测视野，并在5 000×、12 000×和25 000×放大倍数下进行观察和测量。因此，对于每一例样本，共获得15个随机测定的指标数据，借此减少个体差异。
3. 染色与免疫组化：在胎盘母体面垂直取下约1 cm3大小的组织，立即投入4%中性福尔马林液中固定24～48 h后，常规脱水、石蜡包埋，待HE染色及免疫组化染色。
表1 评估合体滋养层细胞细胞浆内囊泡、核固缩、钙化以及绒毛间质水肿和纤维素沉积的半定量标准
Table 1 Semi-quantitative criteria for the evaluation of cytoplasmic vesicles, nuclear shrinkage, calcification, chorionic stromal edema and cellulose deposition insyncytiotrophoblast cells
Observation index0123Cytoplasmic vesicleNoneLittleSomeManykaryopyknosisNoneLittleSomeManyCalcificationNoneLittleSomeManyInterstitial edemaNoneMildModerateSevereFibrin depositionNoneLittleSomeMany
4.称重：胎盘取材后，自胎盘脐带根部剪除脐带称取胎盘重量，记录新生儿出生体重。
5.统计学方法：应用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验；计量资料用
表示，采用 t检验或单因素方差分析，多组间两两比较用采用LSD或Welch检验。对胎盘重量和新生儿体重进行线性相关分析得出相关系数r值。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.孕妇年龄、新生儿体重及胎盘指标比较
正常妊娠组孕妇平均年龄较IVF-ET组和冻融组孕妇低2岁左右，考虑可能与助孕组孕妇年龄相对偏大有关，但三组间差异无统计学意义(表2)。IVF-ET组、冻融组与正常妊娠组比较，胎盘重量、新生儿体重差异也均无统计学意义(表2)。通过线性相关分析，胎盘重量与新生儿体重具有相关性(r=0.78，P<0.05)。
2.三组间胎盘绒毛组织定量比较
IVF-ET组、冻融组与正常妊娠组比较，胎盘末梢绒毛血管数减少，血管占绒毛横切面积比减小(P<0.05)，IVF-EF组与冻融组间差异无统计学意义。三组间绒毛面密度比较，无统计学差异(表3)。
3.三组间胎盘超微结构比较
通过半定量统计对三组胎盘ST细胞浆内囊泡、核固缩、钙化以及绒毛间质水肿和纤维素沉积进行分析(表4)。和正常妊娠组相比，IVF-ET及冻融组来源胎盘的ST细胞浆内更容易出现囊泡样及钙化改变，差异有统计学意义，见图1；余核固缩、绒毛间质水肿和纤维素沉积差异无统计学意义。
表2 孕妇年龄、新生儿体重及胎盘指标在三组间的分布情况
Table 2 Comparison of maternal age, newborn weight and placenta index in three groups
CharasteristicsIVF-ET(n=39)Frozen embryo(n=40)Normal(n=42)Age32.0±3.832.3±2.128.6±3.1placental weight(g)543±151539±156547±149Neonatal weight(g)3 279±5263 258±5313 169±302Placental coefficient(Neonatal weight / placental weight)6.5±1.36.4±1.26.7±1.0
表3 三组间胎盘绒毛组织定量分析比较
Table 3 Quantitative analysis of placental villi in three groups
CharasteristicsIVF-ET(n=39)Frozen embryo(n=40)Normal(n=42)Number of peripheral villusvessels3.4±1.43.4±1.33.5±2.0∗Ratio of vascular to villi area (cross-sectional)0.3±0.40.3±0.20.4±0.2∗Villous surface density (ratio of villi area to total area)0.4±0.10.4±0.00.5±0.0
Note:compared with IVF-ET group and freeze-thaw group,*P<0. 05
表4 三组的胎盘超微结构观察情况分析[例(%)]
Table 4 Analysis of placental ultrastructure in three groups [n(%)]
Observation indexclassifyIVF-ET(n=39)Frozen embryo(n=40)Normal(n=42)Intracytoplasmic vesicles∗01(2.6)1(2.5)14(33.3)111(28.2)11(27.5)23(54.8)222(56.4)24(60.0)5(12.0)35(12.8)4(10.0)0(0)Karyopyknosis 037(94.9)35(87.5)40(95.2)11(2.6)3(7.5)1(2.4)21(2.6)2(5.0)1(2.4)30(0)0(0.0)0(0)Calcification∗028(71.8)26(65.0)11(26.2)111(28.2)14(35.0)31(73.8)20(0)0(0)0(0)30(0)0(0)0(0)Interstitial edema020(51.3)21(52.5)30(71.4)116(41.0)16(40.0)11(26.2)23(7.7)3(7.5)1(2.4)30(0)0(0)0(0)Fibrin deposition03(7.7)5(12.5)10(23.8)126(66.7)25(62.5)26(61.9)28(20.5)7(17.5)6(14.3)32(5.1)3(7.5)0(0)
Note:comparison among the three groups,*P<0.05
图1 IVF-ET组来源胎盘 ST 细胞浆内出现中等量囊泡样改变，Bar=2μm
Figure 1 Moderate vesicular changes in the cytoplasm of ST cells from placenta derived from IVF-ET group, Bar=2 μm
讨 论
正常足月胎盘中约88%的绒毛合体滋养细胞表面，均有发育良好的微绒毛覆盖。 ST顶端微绒毛是参与形成母胎交换界面的重要结构，也是母胎循环之间营养成分和代谢废物交换发生的主要场所。有报道指出顶端微绒毛密度和滋养层细胞成熟度相关[2]，在外界氧气和营养浓度影响以及体外功能性刺激下发生变化[3]。微绒毛密度的下降出现在胎儿宫内生长受限胎盘[4]，先兆子痫胎盘[5]以及其他一些妊娠合并症胎盘中[2]，提示在这些异常妊娠状态中，胎盘微绒毛密度的下降伴有胎盘代谢交换能力的减退。本研究观察到IVF来源胎盘出现了明显的ST顶端微绒毛密度的降低，有些区域甚至发生微绒毛的完全丢失，表明IVF来源胎盘具有较小的屏障交换面积。因此推测人工助孕组胎盘在发生过程中微绒毛密度减少，可能影响胎盘转运代谢功能。
本研究结果显示和正常妊娠组相比，IVF-ET 组和冻融组来源胎盘 ST内出现钙化的发生率明显低于正常妊娠组胎盘，而Lalosevic等[6]则认为ART胎盘出现绒毛水肿以及微钙化的几率提高。IVF-ET 组和冻融组来源胎盘ST细胞浆中出现了中等量的囊泡样结构。有报道表明在GDM妊娠胎盘中可观察到广泛的囊泡样改变[7]。而一项利用体外培养模型的研究发现从足月胎盘分离得到的滋养层细胞在缺氧条件下培养，滋养层细胞细胞浆内出现了较多的囊泡样改变，并伴有葡萄糖代谢和转运的变化[8]。这些被认为是细胞内转运异常的表现形式之一[9]。IVF-ET组及冻融组胎盘中出现较多的囊泡样改变提示其胎盘可能存在滋养层细胞转运异常，并推测这种异常可能是COH周期或胚胎操作过程中局部缺氧所致。但是，到目前为止仍未能有实验证实缺氧即是引起这些病理改变的直接原因。尽管有上述超微结构的改变，但是IVF-ET组和冻融组胎盘的HE组织学没有显著改变，超微结构显示屏障基本结构正常，反映IVF-ET组和冻融组胎儿发育的宫内环境、营养、屏障等与自然妊娠胎儿是基本相同的，且IVF-ET组和冻融组间差异无统计学意义，因此没有证据证明COH周期是导致IVF-ET 组和冻融组胎盘出现上述改变的原因，关于胎盘某些超微结构上的差异还需继续深入研究。
1 Forman RG,Frydman R,Egan D,et al.Severe ovarian hyperstimulation syndrome using agonists of gonadotropin-releasing hormone for in vitro fertilization:a Europeanseries and a proposal for prevention.Fertil Steril,1990,53:502-509.
2 Biagini G,Vasi V,Pugnaloni A,et al.Morphological development of the human placenta in normal and complicated gestation:a quantitative and ultrastructural study.Gynecol Obstet Invest,1989,28:62-69.
3 Wu F,Tian FJ,Lin Y.Oxidative Stress in Placenta:Health and Diseases.Bio Med Res Int,2015,2015:1-15.
4 崔世红,孙俊燕,陈娟等.胎儿生长受限危险因素及分娩时机的分析.中国医学创新,2015,34:60-63.
5 Zhang X,Jia H,Wang Y,et al.Early and late onset severe preeclampsia:a clinicopathologic study of 178 placentas.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi.2015 Dec;44:879-83.
6 Lalosevic D,Tabs D,Krnojelac D,et al.Histological characteristics of placentas from assisted reproduction programs.Med Preg,2003,56:521-527.
7 Jayabalan N,Lai A,Ormazabal V,et al.Adipose tissue exosomal proteomic profile reveals a role on placenta glucose metabolism in gestational diabetes mellitus.J Clin Endocrinol Metab.Doi:10.1210/jc.2018-01599.
8 Esterman A,Greco MA,Mitani Y,et al.The effect of hypoxia on human trophoblast in culture:morphology,glucose transport and metabolism.Placenta,1997,18:129-136.
9 张婉怡,杨慧霞.妊娠期高血糖胎盘葡萄糖转运代谢的研究进展.中华围产医学杂志,2018,21:687.