叉头框转录因子3a和β-连环蛋白在胚胎停育绒毛组织中的表达及意义

胚胎停育是指因受精卵缺陷或母体存在不利妊娠的因素，如遗传因素、免疫因素、感染、母体内分泌失调、细胞增殖和凋亡、血栓因素、解剖异常、环境因素等，导致早期或中期胚胎死亡，全部或部分的组织留在宫腔内未能自然排出的一种病理性妊娠，病因十分复杂，有约40%～50%的胚胎停育原因未明[1]。胚胎停育是一种特殊类型的自然流产，近年来，发病率有明显升高趋势，这对孕妇的身心健康造成严重影响，因此，探究胚胎停育的病因，为早期预防以及改善妊娠结局提供新的理论依据显得尤为重要。叉头框蛋白O家族的核心是叉头框转录因子3a(forkhead box O transcription factors 3a,FoxO3a)，目前研究发现其在细胞、组织与胚胎发育、卵泡成熟、血管生成、免疫反应及细胞凋亡等过程中发挥重要作用[2-3]。β-连环蛋白(β-catenin)是一种多功能胞内蛋白，既是Wnt/β-catenin通路中的信号传导分子，又是细胞间重要黏附分子，这两种功能可相互独立发挥作用。一方面，可作为转录辅助激活因子，参与转录的激活；另一方面，可参与锚定细胞骨架与E-钙黏蛋白(E-cadherins)，涉及细胞-细胞黏附接头的组成，在子宫内膜蜕膜化期间的细胞黏附中起重要作用[4]。本文旨在使用免疫组织化学技术SP法检测胚胎停育患者绒毛中FoxO3a和β-catenin的表达情况，初步探讨二者的作用及其与绒毛滋养细胞过度凋亡的关系。

对象与方法

一、研究对象

选取2017年10月—2018年6月就诊于包钢集团第三职工医院妇产科门诊，经彩超证实为胚胎停育者30例，停经7～11周，年龄24～37岁，平均年龄(29.6±2.5)岁。随机选取同期正常妊娠，经彩超证实为宫内早孕有胎心搏动，自愿要求负压吸引术流产者30例，停经6～9周，年龄20～40岁，平均年龄(27.1±4.1)岁。两组研究对象既往月经周期规律，在取标本前3个月内均未服用激素类药物，未放置宫内节育器，无生殖道感染，无内外科合并症，术前签署知情同意书。比较两组年龄、孕周及体重指数，差异均无统计学意义(P>0.05),男方年龄差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

二、方法

1.标本采集与免疫组织化学技术SP法处理：负压400 mmHg吸引出入选研究组、对照组的绒毛组织及蜕膜等宫腔内容物后，绒毛组织置于生理盐水中漂洗，洗净表面血迹后取标本约0.5×0.5×0.5 cm3置于体积分数为10%中性甲醛固定液中固定并石蜡包埋，每个组织标本蜡块按厚度4 μm连续切片2张，分别采用链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidn peroxides conjugated method，S-P法)检测FoxO3a和β-catenin的表达。常规脱蜡水化、抗原热修复后，严格按试剂盒(KIT-9710，购自福州迈新公司)说明书进行实验步骤。兔抗人FoxO3a多克隆抗体(ab70314)购于美国ABCAM公司，鼠抗人β-catenin单克隆抗体(610154)购自美国BD生物技术公司，二者稀释浓度均为1:200。自然晾干后阅片，阳性对照为试剂公司所提供的阳性片，PBS代替一抗作为阴性对照。

2.结果判定：由2位病理医师采用双盲法在光镜下进行观察和评定。每张切片随机选取 5个视野，每个视野计数100个细胞。FoxO3a及β-catenin均主要表达于滋养细胞的细胞质和细胞核，β-catenin在正常妊娠组部分表达于细胞膜，二者阳性信号均为出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。根据显色强度和阳性细胞百分率进行半定量判定。(1)按照显色强度分为无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别评为0、1、2、3分。(2)按照阳性细胞百分率计为<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，>50%计3分。最后根据两者乘积，(1)×(2)，将染色情况分为4级：0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～6分为(++)，>6分为(+++)。乘积<2分判定为阴性(-)，≥2分判定为阳性(+)。

3.统计学处理：采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用

表示，数据符合正态分布用独立样本t检验，不符合正态分布采用中位数表示，用Mann-Whitney U检验，FoxO3a及β-catenin的阳性表达率用χ2检验，二者的相关性比较用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、两组滋养细胞中FoxO3a的表达情况

FoxO3a主要表达于胚胎停育组滋养细胞的细胞质和(或)细胞核，正常妊娠组滋养细胞的细胞质(图1)。FoxO3a在胚胎停育组、正常妊娠组绒毛滋养细胞中阳性表达率分别为36.7%(11/30)和63.3%(19/30)，FoxO3a在胚胎停育组阳性表达率低于正常妊娠组，差异有统计学意义，见表2。

二、两组滋养细胞中β-catenin的表达情况

β-catenin主要表达于胚胎停育组滋养细胞的细胞质和(或)细胞核，正常妊娠组滋养细胞的细胞膜和(或)细胞质(图2)。β-catenin在胚胎停育组、正常妊娠组绒毛滋养细胞中阳性表达率分别为56.7%(17/30)和26.7%(8/30)，β-catenin在胚胎停育组阳性表达率高于正常妊娠组，差异有统计学意义，见表2。

三、两组滋养细胞中FoxO3a与β-catenin表达的相关性

FoxO3a与β-catenin在胚胎停育组中的表达呈负相关性(rs=-0.591，P<0.05)，二者在正常妊娠组中的表达无相关性(rs=-0.099，P>0.05)，见表3。

讨论

一定程度的滋养细胞凋亡在正常妊娠生理活动中是存在的[5]，主要发生在合体滋养层细胞，在胚胎生长发育过程中，增殖-凋亡的状态平衡利于形成绒毛内血管及分支并保持相关的侵袭能力[6]。当某因素导致增殖-凋亡的平衡状态被打破后，绒毛胎盘血管增殖不良，滋养细胞侵袭力降低，绒毛凋亡增加，生长发育受阻，最终导致胚胎停育，这可能是早期自然流产发生的一个重要病理过程。近期研究表明，自然流产妊娠组织中存在着过度凋亡，而且过度凋亡的发生与促凋亡基因的高表达有关[1]。有学者研究显示，FoxO3a可诱导促凋亡因子表达，进而激活半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，使卵母细胞、淋巴细胞、神经元以及肿瘤细胞等多种细胞发生凋亡[7-9]。而FoxO3a在合体滋养细胞胞质的高表达可有利于维持妊娠[10]。FoxO3a在细胞核和细胞质等亚细胞结构中的定位受磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt) 信号通路影响，对凋亡的调节产生重要作用[11-13]。KIM等[11]推测正常早期妊娠滋养细胞中FoxO3a磷酸化后被转运至胞质处在失活状态，阻碍凋亡基因表达可使合体滋养细胞维持正常生理状态；而稽留流产滋养细胞FoxO3a在胞质中表达下降，并出现较多胞核内表达，去磷酸化的 FoxO3a大部分进入胞核，使凋亡基因表达最终加速细胞凋亡，从而导致绒毛正常发育的平衡状态失衡引起胚胎停育。本实验与其研究结果一致，本实验中FoxO3a在胚胎停育组绒毛滋养细胞中阳性表达率低于正常妊娠组，差异有统计学意义。

胚胎发育过程中Wnt/β-catenin信号通路参与调控胚胎干细胞分化、凋亡和定位等生物学过程。胚胎附着子宫内膜的过程是着床，成功着床的标志是胎盘血管形成及母体蜕膜滋养细胞侵袭。Wnt/β-catenin信号通路调控胚胎着床包括2个方面：激活胚胎植入位点上皮细胞调节靶基因的表达，使胚胎着床后的血管重塑胎盘形成；在胚胎植入前激活子宫环形平滑肌，调节胚胎对子宫内膜的黏附和侵入。胚胎着床窗子宫内膜β-catenin蛋白表达暂时性下调或缺失,有利于促进子宫内膜上皮细胞的分离和胚胎着床[14]。本实验发现，β-catenin在胚胎停育组绒毛滋养细胞中阳性表达率高于正常妊娠组，差异有统计学意义。这提示β-catenin在胚胎停育过程中扮演着重要角色。

本实验得出胚胎停育组绒毛滋养细胞中FoxO3a与β-catenin表达呈负相关，提示二者可能共同参与了细胞过度凋亡和胚胎停育的过程。二者在诸多细胞生命活动中有重要意义，其相互之间作用可影响各自表达和功能，从而调控细胞凋亡。如FoxO3a能可逆性同T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)竞争结合β-catenin，阻断Wnt信号通路下游靶基因的激活。FoxO3a靶基因GABARAPL1可通过促进自噬降解Dvl2蛋白抑制Wnt/β-catenin信号通路[15]。有学者在一项实验中证实当实验组加入抑制剂后，β-catenin的表达被抑制，而FoxO3a的表达较对照组升高，提示FoxO3a受Wnt/β-catenin负调控，可能是其下游分子[16]。综上所述，FoxO3a与β-catenin在胚胎停育过程中发挥重要作用，更深入研究二者在发生胚胎停育信号通路中的具体机制，明确胚胎停育细胞过度凋亡的发病机理，将为早期预防及改善妊娠结局提供新的理论依据。

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