荧光原位杂交技术(flourescence in situ hybridization，FISH)是将分子生物探针与染色体特定位点结合来检测染色体异常的一类技术。在上世纪80年代中期，D’Alton等[1]应用FISH技术检测到间期细胞核中数目异常的染色体。理论上FISH技术可以检测所有染色体数目异常，由于13、18、21号以及X、Y染色体发生非整倍体畸变的频率较高，占所有染色体病的65%～80%，因此设计这五条染色体的探针将其应用到产前诊断中可以快速检测常见染色体非整倍体畸变，易于普及，并具有一定临床应用价值。
对象与方法
1. 研究对象：本研究对象来源于2015年1月—2017年6月期间在内蒙古自治区妇幼保健院进行产前诊断的孕妇。孕妇年龄分布为18～46岁，平均年龄(33.0±5.8)岁；孕周大多集中在22周左右，其中最小孕周为17周+1天，最大33周。
2 .实验方法：采集筛查高风险、超声提示胎儿异常以及高龄孕妇的羊水199例，进行核型分析及FISH检测。
(1)染色体核型分析实验方法：离心收获羊水细胞，加入5 ml培养液，分装入两个培养瓶中，在37℃温箱中培养，培养7～8天后换液。在第10～12天，镜检细胞群落长势良好，则加入秋水仙素，继续培养2～4 h；处理后取出培养瓶，加入EDTA胰酶消化。收集培养后羊水细胞进行低渗、固定再处理、滴片、烤片后进行染色体镜检。
(2)FISH检测实验方法：玻片样本处理，探针杂交，洗片，DAPI染色。阅片：荧光显微镜下随机计数50个强信号且无重叠的杂交细胞。结果判读：镜下阅片若大于90%的核型显示非整倍体信号则判断为异常。若10%～60%的核型显示非整倍体信号则判断为嵌合体。如果无法判断则扩大计数100个细胞。
3.实验主要仪器及试剂：实验主要仪器有荧光原位杂交系统，染色体分析系统，培养箱。实验主要试剂为DNA FISH探针(北京金菩嘉公司18、X、Y、21、13五色探针)。
4.数据统计和分析：使用SSPS 19.0软件对实验数据进行统计学分析，计数资料用百分数或者率(%)表示。
结果
1. 染色体核型分析结果：进行产前诊断的主要为血清学筛查高风险、无创筛查高风险、高龄以及超声异常等病例，本研究中共检测出染色体非整倍体63例，占总检测数的31.7%。具体各组染色体异常情况见表1。
2. 染色体异常分类情况对比分析：对所有研究对象进行染色体核型分析和FISH检测发现，有2例染色体核型分析未检测到异常，而FISH检测结果为21-三体。13-三体和18-三体检测结果FISH与核型分析完全一致。性染色体异常组FISH漏诊1例核型为47，XXY，FISH检测为两个X信号，未发现Y信号，标本状态显示血性羊水，考虑为母血污染。在结构异常组，核型分析为罗氏易位型13-三体及21-三体的样本均成功检测。FISH探针采用的是特异位点探针和着丝粒探针，1例18号染色体短臂的部分缺失由于不是本研究检测的目标区域，未成功检测。1例9号多态、1例嵌合体漏诊。核型分析正确率为96.9%(63/65)，FISH检测正确率为93.8%(61/65)，结果见表2。
表1 染色体核型结果分析
临床分类 检测数目核型异常数目异常检出率(%)超声异常55916.4唐氏筛查高风险3339.1无创筛查高风险312787.1唐氏+无创筛查高风险111090.9高龄2813.6不良育史500无创性染色体高风险16425.0无创21以外染色体高风险20945.0总数1996331.7
表2 五色探针检测情况分析
染色体异常情况例数核型分析FISH核型分析与FISH检测差异21-三体454345218-三体999013-三体1110性染色体4431结构异常6633总数6563616
3. 核型分析染色体结构异常6例情况及两种检测方式漏检、培养失败情况分析：两种检测方式不一致的病例详情见表3。核型分析结果为结构异常的6例病例，均不在FISH检测探针设计范围之内。但是其中核型分析为罗氏易位的FISH结果与核型结果一致。同时由于FISH技术不能准确检测嵌合体，故漏检1例。染色体核型分析培养失败的3例均经FISH检测成功。
表3 核型分析结构异常、核型培养失败及FISH漏检情况
编号原因 核型 FISH1胎儿脑中线前部未显示46,XN der(13;14)(q10;q10),+1313-三体2DS:1/291,无创DS高风险46,XN der(14;21)(q10q10),+2121-三体3胎儿鼻骨显示不清46,XN der(21;21)(q10;q10),+2121-三体4B超:胎儿鼻骨短(0.3cm)47,XN+der(21;21)(q10;q10)[18]/46,XN[32]未见异常5无创ES高风险,NT:0.32cm46,XN del(18)(p11)未见异常6DS:1/15946,XN inv (9)(p11q13)未见异常7唐氏筛查高风险培养失败未见异常8无创筛查高风险培养失败21-三体9唐筛无创同时高风险培养失败21-三体10高龄,无创性染色体异常47,XXY漏诊
讨论
1. FISH检测技术在临床应用方面的优势：目前，依赖于G显带的染色体核型分析技术仍是染色体疾病诊断的“金标准”，可以准确地检出染色体非整倍体，也可以检测一定范围的结构异常。但受到自身技术的局限仍有一些不足之处，诊断周期长，对孕周要求严，实验失败率高等[3]。
本研究中的199例羊水标本培养时间范围在14～28 d不等，平均检测时间在21 d左右，最长1例培养时间为31 d。核型培养失败3例，培养成功率为98.5%。发放报告时间在24～48 h内。研究中，培养失败的3例孕妇均拒绝进行二次羊水穿刺，经FISH检测，2例胎儿诊断为21-三体，1例胎儿正常。由于FISH技术是用已知核酸序列作为探针与靶DNA进行原位杂交，观察荧光信号进行诊断，降低了实验操作与结果分析的难度[4]。Choolani M等[5]认为当羊水细胞难以培养时，在检测量大的实验室可以应用FISH代替核型分析来检测染色体异常。
2. FISH可以准确检测染色体非整倍体：FISH检测技术具有良好的实用性，灵敏度和特异性分别可达99.9%和100%[6]。由于在目前所有的染色体非整倍体畸变中，21、18、13号及性染色体非整倍体发病率约占65%～80%[7]，检测这几类常见染色体数目，可满足部分产前诊断的需要。本研究检出65例异常结果，1例9号多态、1例18号短臂缺失和1例嵌合体外，余下62例(95.4%)均为常见染色体非整倍体。
3. FISH技术目前存在的一些局限性：一般认为，FISH技术难以检出嵌合体。嵌合体患儿体内嵌合细胞比例，将决定杂交信号的检出率。对于较小的嵌合体，FISH难以做出精确判断，必须结合核型分析结果来全面判断。FISH也不能进行探针设计目标结构区外异常的检测。因此在产前诊断过程中要把握好应用指征，准确定位，与核型分析的结果相互补充。
综上所述，FISH技术在产前遗传性疾病检测中，可以对常见染色体非整倍体进行准确的检测。可以与核型分析互为补充，为临床提供更全面的服务。
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