胎儿染色体非整倍体无创检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)通过采集孕妇外周血，提取总游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物学信息分析，计算出胎儿游离 DNA(cell-freefetal DNA，cffDNA)相对含量，得出胎儿染色体异常的风险率。由于不需要进行创伤性取样，具有高敏感性和高特异性，已越来越受到临床的重视[1]，它能使胎儿21-三体综合征检出率达到 99%[2-3]，作为一种新的、近似于诊断水平[4]的筛查胎儿染色体非整倍体技术应用于临床。本文通过对在本院接受NIPT 的697例高危孕妇的检查结果进行回顾性分析，以探讨NIPT在诊断高危孕妇胎儿染色体非整倍体疾病中的临床应用价值。
资料与方法
1. 一般资料：选择2014年5月—2017年7月，在本院产科门诊确定为高危孕妇697例，孕妇年龄19～45岁，平均年龄(33.0±5.3)岁。高危因素为高龄孕妇(预产期年龄>35岁)355例占50.9%、唐氏综合征血清学筛查高风险225例占32.3%、唐氏综合征血清学筛查临界风险86例占12.3%，既往有不良孕产史31例占4.4%。孕周 12～28 周，均为单胎，进行NIPT。唐氏综合征高风险值≥1/270，临界风险1/270～1/1000，低风险<1/1000。18-三体综合征高风险值≥1/350，临界风险1/350～1/1000，低风险<1/1000。采用统一知情同意书，充分告知孕妇 NIPT 的临床适应征、检测范围、局限性及可能存在的风险[5]，由孕妇自愿选择并签署知情同意书。
2. 方法：(1)孕妇外周血胎儿游离DNA检测。采集孕妇外周血10 ml于Streck采血管中，由广州达安临床检验中心按SOP 文件使用DNA提取试剂盒(达安基因)提取血浆中游离DNA，利用文库构建试剂盒(达安基因)构建DNA文库，将构建好的文库样品通过荧光定量PCR仪进行文库定量。利用第2代测序仪DA8600进行上样和测序。将测序结果进行生物信息学分析，得出胎儿发生染色体非整倍体疾病的风险率。(2)结果验证及随访。对NIPT结果为高风险者，由郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心，进行B超引导下羊膜腔穿刺术，抽取羊水20 ml，经实验室培养后，常规制备染色体经G显带后染色体核型分析。对NIPT结果为低风险的孕妇随访妊娠结局及胎儿出生后的情况。
3.统计学分析：采用 SPSS 17.0 进行统计分析。计数资料用百分数(%)表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
结果
1. 孕妇NIPT结果：高危孕妇共 697例，NIPT结果为非染色体整倍体疾病高风险者共 12例：21-三体综合征 7例，18-三体综合征 4例，13-三体综合征 1例。其中高龄组355例，检出21三体综合征3例(0.8%)，18三体综合征2例(0.6%)，13三体综合征1例(0.3%)，共检出高风险者6例(1.7%)；唐氏综合征血清学筛查高危组225例，检出21三体综合征4例(1.8%)，18三体综合征1例(0.4%)，共检出高风险者5例(2.2%)。唐氏综合征血清学筛查临界组86例，检出18三体1例(1.2%)，不良孕产史组未检出高风险患者。见表 1。
2. 孕妇NIPT检测结果与羊水染色体核型分析结果比较：对于12例无创检测结果高风险者，均进行了羊水染色体核型分析。经分析，NIPT技术对于胎儿非整倍体染色体疾病与羊水穿刺染色体核型分析技术阳性符合率为100%。见表 2。阳性患者均终止妊娠，NIPT结果低风险者685例，经随访，截至 2018 年6月31日新生儿均已出生，家属自述均正常。
3.高龄组孕妇年龄与染色体非整倍体疾病的关系：参与研究的高龄孕妇共355例，其中孕妇年龄35～39岁，292(82.3%)例，胎儿染色体非整倍体疾病发生率为1.0%(3/292)；孕妇年龄>40岁，63(17.7%)例，胎儿染色体非整倍体疾病发生率为6.3%(4/63)；(见表3)。孕妇年龄>40岁，胎儿染色体疾病发病率高于35～39岁组(χ2=7.593，P=0.06)。
表1 高危孕妇NIPT结果分析[n(%)]
组别总数(n)NIPT结果21三体 18三体 13三体 合计 高龄组3553(0.8)2(0.6)1(0.3)6(1.7)唐氏高危组2254(1.8)1(0.4)0(0)5(2.2)唐氏筛查临界860(0)1(1.2)0(0)1(1.2)不良孕产史310(0)0(0)0(0)0(0)合计6977(1.0)4(0.6)1(0.1)12(1.7)
表2 NIPT高风险与羊水细胞染色体核型分析结果比较
高风险类型无创DNA检测结果(例)羊水穿刺证实(例)阳性阴性阳性符合率(%)21-三体77010018-三体44010013-三体110100合计12120100
表3 孕妇年龄与染色体疾病发生率的关系[n(%)]
年龄(岁)高风险例数[n(%)]低风险例数[n(%)]35～393(1.0)289(99.0)>404(6.3)∗59(93.7)
注：与年龄35～39岁组比较，P=0.06
讨论
随着我国二胎政策的放开，高龄孕妇和唐氏筛查高风险人数不断增加，如何采取更有效的方法来提高染色体非整倍体疾病的检出率并减少不必要的有创操作是目前临床上急需解决的问题。传统的产前诊断技术，包括绒毛穿刺、羊水穿刺、脐血穿刺，具有染色体核型分析高准确率的优点，且能分析出除了染色体数目异常外的结构异常，为产前诊断的临床金标准[6] ，但是取样时却存在0.5%～2%的流产风险，容易导致胎膜早破、绒毛羊膜炎、阴道出血、早产等并发症。而无创产前检测具有高准确性、无创伤性等优点且有效降低了侵入性操作引起的流产、感染等风险，易被孕妇接受，同时其适用于孕 12～26周，克服了传统产前诊断技术在取材以及检测时间等方面的缺陷和限制，可广泛应用于临床。
对本资料提供的697 例唐氏高危孕妇进行NIPT，并对高危患者进行胎儿羊水染色体核型分析。结果表明孕妇外周血游离胎儿 DNA 检测技术与羊水染色体核型分析的阳性符合率为100%，本文NIPT对唐氏综合征检出率高于报道的99%[3,6-7] ，未出现假阳性、假阴性可能是因为样本数量有限，需要进一步积累样本。胎儿13-三体综合征的发病率低，约为 1∶25000[8] ，本研究13-三体综合征检出1例。说明无创DNA 检测技术可以作为传统产前诊断技术的有效辅助手段[9] 。但对于非整倍体和染色体结构异常的确诊仍需通过羊水或脐带血进行染色体核型分析。
孕妇年龄35～39岁胎儿染色体非整倍体疾病发病率为1.0%(3/292)，孕妇年龄>40岁胎儿染色体非整倍体疾病发病率升高到6.3%(4/63)。结果与先前的研究结果一致[10]。近几年随着生育年龄的推迟和二胎政策的放开，因年龄因素直接做产前诊断的孕妇逐渐增多。传统的羊膜腔穿刺会有0.5%～1%的流产风险，这对于高龄孕妇也是一个顾虑。近年来新发展的孕妇外周血游离DNA高通量测序技术，已被临床研究证实在检测染色体非整倍体疾病方面的敏感度和特异度与传统的核型分析技术有较高的一致性[11]，这种无创DNA产前检测作为传统细胞遗传学的补充，可以解决目前产前诊断技术力量不足的问题，也将会是以后产前筛查和诊断体系的发展方向。
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