CPEB4沉默对宫颈癌Siha细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率一直居高不下，严重威胁着全球女性的身心健康[1-2]。随着细胞筛查技术和治疗技术的不断进步，宫颈癌的诊断和治疗已明显改善[3]。然而由于早期临床症状不明显，许多患者发现时已为晚期且往往伴随着远端转移，预后极不理想[3]。因此，进一步探索宫颈癌的发生发展机制，寻找宫颈癌的早期诊治靶标，对于宫颈癌的治疗和改善预后具有重大意义。胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，CPEB4)是一种RNA结合蛋白，可调控许多信使RNA的表达[4-5]。CPEB4已被证实在多种肿瘤中存在异常表达，且与癌症细胞的凋亡、侵袭和迁移等密切相关[5]，但其在宫颈癌中的表达及其具体功能还知之甚少。本文旨在研究CPEB4在宫颈癌组织样本中的表达，并通过下调CPEB4的表达，研究其对宫颈癌Siha细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为宫颈癌的诊治寻找新靶点。

材料和方法

一、材料与试剂

经患者知情同意后，收集本院2017年5月—2018年5月就诊并行手术治疗的42例宫颈癌患者，患者年龄25～58岁，平均(38.3±4.2)岁，采集手术切除的癌变组织及其正常癌旁组织，诊断依据病理结果。人宫颈癌Siha细胞购自中国科学院上海细胞库。DMEM细胞培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；实时定量PCR检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；PCR引物、CPEB4 siRNA和scrambled siRNA均由上海生工生物工程公司合成； TRIzol试剂、脂质体LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen 公司；RIPA裂解液、CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天公司；Transwell小室、Matrigel胶购自美国BD公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；CPEB4、P53、Twist1、GAPDH抗体及二抗均购自美国Abcam公司。

二、方法

1.实时定量PCR：TRIzol法分别提取宫颈癌及其癌旁组织总RNA，按照实时定量PCR检测试剂盒说明书操作，以GAPDH为内参，检测各组织中CPEB4 的mRNA相对表达量。CPEB4的引物序列为上游5′-CGCCTTCCTCCTCTACAATA-3′、下游5′-ACAGAGCACCGTTATTATTAGCC-3′。GAPDH的引物序列为上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后 72 ℃延伸 8 min。

2.细胞培养及siRNA转染：将宫颈癌Siha细胞培养于含有10% 胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞汇合度达到80% 左右，胰酶消化传代，取对数期的细胞用于实验。转染前24 h，将细胞按照3×105 个/孔接种于6孔板，无血清培养基培养过夜，待细胞汇合度达到50%左右时，按照脂质体LipofectamineTM3000说明书操作，将CPEB4 siRNA或其阴性对照scramble siRNA 转染至Siha细胞，在37 °C、5% CO2条件下孵育5 h，更换为血清的培养基继续培养以供后续试验。

3.CCK-8细胞增殖实验：细胞转染后24 h、48 h、72 h、96 h 后终止培养，按照CCK-8细胞增殖检测试剂盒说明书操作，检测细胞增殖活性。向每孔细胞中加入20 μl CCK-8溶液，37 °C孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。

4.Transwell细胞迁移和侵袭实验：细胞转染48 h后，胰酶消化细胞，消化制备细胞悬液，以无血清培养液重悬细胞，浓度为1×106 cells/ml。检测细胞迁移时，取100 μl细胞悬液加入Transwell上室，600 μl含10%血清的DMEM培养液加入Transwell下室，在37 °C、5% CO2条件下培养，24 h后采用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% 结晶紫染色15 min，倒置小室，显微镜下计数。检测细胞侵袭时，先向Transwell小室上均匀铺上以无血清培养基稀释的Matrigel基质胶，待成胶后再加入细胞悬液，其余操作同细胞迁移实验。

5.Western blot实验：采用RIPA裂解提取分癌组织、癌旁组织和癌细胞中的总蛋白，经10% SDS-PAGE分离后电转移至PVDF膜，用5% 脱脂奶粉溶液常温封闭1 h后，分别加入抗CPEB4、P53、Twist1、GAPDH的抗体，4 ℃孵育过夜，再加入二抗，常温孵育1 h，加入发光液，显色成像，采用ImageJ分析条带。

6.统计学处理：所有实验均重复3次，结果数据以均数±标准差表示。应用SPSS 22.0软件对数据进行统计学处理，采用组间单因素方差分析或LSD-t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、CPEB4在宫颈癌组织中的表达

比较宫颈癌组织和癌旁正常组织中CPEB4的表达，结果显示，CPEB4 mRNA在宫颈癌组织中的表达显著高于癌旁组织(图1，P<0.05)，且CPEB4蛋白的表达较癌旁组织也显著上调(图1，P<0.05)，提示CPEB4的异常上调可能在宫颈癌的发生发展中起重要作用。

二、CPEB4表达下调对宫颈癌Siha细胞增殖的影响

干扰CPEB4基因在宫颈癌Siha细胞中的表达(图2，P<0.05)，观察细胞增殖能力的改变。结果显示，与对照组相比，转染CPEB4 siRNA后，Siha细胞增殖能力显著降低(图2，P<0.05)。

三、CPEB4表达下调对宫颈癌Siha细胞迁移和侵袭的影响

与对照组相比，转染CPEB4 siRNA后，Siha细胞的迁移和侵袭能力均显著下降(图3，P<0.05)。

四、CPEB4表达下调对P53和Twist1蛋白表达的影响

为探究CPEB4影响宫颈癌Siha细胞增殖、迁移和侵袭的可能机制，检测CPEB4基因沉默前后，Siha细胞中增殖相关蛋白P53和迁移侵袭相关蛋白Twist1的表达。结果显示，与对照组相比，转染CPEB4 siRNA后，Siha细胞中P53蛋白表达显著上调，Twist1蛋白表达显著下调(图4，P<0.05)。

CPEB4可以调控多种信使RNA的表达，进而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成以及侵袭迁移等[4-5]。研究发现，CPEB4在乳腺癌、胶质瘤、胃癌等多种癌症中高表达[6-8]，其表达异常影响着这些癌症的发生和发展，但其在宫颈癌中的表达及其具体功能仍不清楚。本研究发现，CPEB4在宫颈癌患者癌组织中的表达水平显著高于相应癌旁组织；沉默CPEB4在宫颈癌Siha细胞中的表达可导致细胞增殖活性减弱、迁移和侵袭能力降低，其机制可能与P53蛋白表达上调、Twist1蛋白表达下调有关。

研究表明，与正常组织或癌旁组织相比，CPEB4在胰腺癌组织、乳腺癌组织和胶质瘤组织中均表达上调[4,6-7]。与这些研究类似，本研究发现宫颈癌组织中CPEB4 的mRNA 和蛋白表达水平均显著高于癌旁组织，提示CPEB4可能参与了宫颈癌的发生和发展。

癌症是以细胞异常增殖和转移为主要特点的疾病，因此抑制癌细胞的异常增殖和转移侵袭有助于限制癌症的发生和发展。研究发现，采用siRNA干扰CPEB4的表达能够显著抑制胆囊癌细胞的增殖和克隆形成能力[9]。沉默胃癌细胞中的CPEB4表达亦可抑制胃癌SGC7901细胞的增殖[8]。与这些发现类似，本研究结果显示，沉默CPEB4在宫颈癌Siha细胞中的表达，细胞的增殖活性显著降低，提示通过调控CPEB4的表达能够影响宫颈癌细胞的增殖。

癌症细胞发生侵袭转移往往会导致治疗失败，也成为癌症患者死亡的主要原因。在乳腺癌MCF7细胞和胶质瘤T98G细胞中过表达CPEB4均可促进细胞的迁移和侵袭，而在乳腺癌MDA-MB-231细胞和胶质瘤SKMG-4细胞中敲除CPEB4均能抑制细胞的迁移和侵袭[6-7]。抑制CPEB4表达也可减少胆囊癌GBC-SD细胞、胃癌SGC7901的迁移和侵袭[8-9]。本研究发现，沉默CPEB4在宫颈癌Siha细胞中的表达，细胞的迁移和侵袭能力均显著下降，提示CPEB4的表达能够影响宫颈癌细胞的迁移和侵袭。

作为一种肿瘤抑制基因，P53被发现在宫颈癌中低表达，且与宫颈癌细胞的增殖、侵袭等密切相关[10-11]。Twist1是细胞上皮间质转化的重要调控因子，在宫颈癌中存在高表达，与宫颈癌细胞的发生、浸润和转移密切相关[12-13]。本研究发现，沉默CPEB4在宫颈癌Siha细胞中的表达，细胞中P53蛋白表达上调、Twist1蛋白表达下调，提示CPEB4可能通过调控P53和Twist1的表达影响宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移。然而影响癌症细胞生物学行为的因素有很多，CPEB4发挥功能所涉及的具体信号调控网络仍有待于进一步的研究探讨。

综上所述，在宫颈癌中存在CPEB4的异常高表达，其可能通过调控P53、Twist1 蛋白表达影响宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。CPEB4有望成为宫颈癌诊断标志物及潜在的治疗靶点，然而其发挥功能所涉及的具体信号调控网络尚需进一步研究。

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