宫颈癌(cervical cancer, CC)是全球主要影响女性生殖健康的恶性肿瘤之一，在发展中国家，CC病理检测占世界女性癌症死亡病例的60%以上[1-2]。临床研究发现，病毒感染、遗传变异、营养不良和免疫功能紊乱等是CC发生发展的重要驱动因子，其中，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是浸润性CC的重要发病诱因，特别是HPV16和HPV18[3-4]。流行病学研究表明，99.4%的CC患者感染该HPVs病毒[5]。然而，目前基于HPV的CC的诊断及各种治疗结果并不能获得良好的效果，因此进一步揭示CC的发生发展及治疗迫在眉睫[6]。
微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一类长度约为19至24个核苷酸的单链和非编码小RNA分子，其通过形成不完全碱基配对靶信使RNA进行降解或翻译抑制的基因表达的转录后调节因子，已被证明参与多种细胞生长调控和生理病理功能，并且可作为生物标记物(biomakers)用于诊断疾病发生和监测疾病发展[7]。研究显示，miR-21高表达于CC，且通过调控TIMP3、PTEN/AKT通路、肿瘤坏死因子-alfa(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等参与调控CC细胞增殖、凋亡和迁移[8-9]。miR-21更具有改善耐药性和调控细胞自噬等多种作用，因此在CC治疗与诊断应用方面前景广阔[10-11]。
Cylindromatosis(CYLD)是一种肿瘤抑制基因，在称为圆柱状瘤病的良性皮肤肿瘤综合征中发生突变，其表达产物为去泛素化酶，主要通过抑制NF-κB信号传导来调节细胞增殖、细胞存活和炎症反应[11]。CYLD作为肿瘤抑制分子参与调控细胞周期、下调促癌基因(Proto-oncogene)BCl-3表达，并且在肺癌细胞中的表达受到miR-21调控[12]。然而，miR-182-5p作为CYLD的又一调控分子，其低表达于CC[13-14]。CYLD是否参与CC的发生发展及其作用尚不明确，且CC高表达的miR-21是否通过CYLD参与CC细胞生长尚未可知。
因此，本研究拟检测CC组织与癌细胞中miR-21表达变化和CYLD蛋白表达，并通过干扰miR-21表达，观察miR-21对CC细胞增殖、细胞周期相关及CYLD蛋白的影响。
资料与方法
一、资料
选取2016年01月至2018年06月进入内蒙古自治区人民医院救治的56例CC患者和同期健康志愿者67例，收集外周血并分离血浆后与CC患者肿瘤病变组织和癌旁组织共同冻存于-80 ℃备用，检测HPV16、HPV18和miR-21含量等。本实验研究经本院伦理委员会审核批准，所有患者、志愿者均对本研究知情并签署知情同意书。
人宫颈上皮永生化细胞H8和人CC细胞系：腺癌样SiHa、HeLa (上皮样宫颈癌epithelioid cervical carcinoma)和Caski (表皮样囊肿宫颈, epidermoid cervical carcinoma) 以及MS751、C33A、C4-I、C4-II细胞均购自中国科学院上海细胞库，Lipo2000、DMEM高糖培养基和cDNA合成试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，胎牛血清购自美国Ausgene公司，TRizol RNA提取试剂盒、RIPA裂解液、Cocktail、磷酸化酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL显影液和HRP-山羊抗兔二抗购自武汉塞维尔生物技术有限公司)，SYBGreen qPCR Mix购自北京宝日医生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自天中国碧云天公司，miR-21、U6 qPCR引物和miR-21抑制剂(miR-486-5p inhibitor)购自广州锐博生物科技有限公司，CCND1、CCNE、CDK4、CDK6和ACTB qPCR引物购自武汉擎科生物科技有限公司，兔抗人CYLD、b-actin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4和CDK6抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。
二、方法
1. HR-HPV检查：将宫颈外口的分泌物和其他液体清理干净后，收集分泌物于无菌玻璃管中，采用HPV基因分型检测试剂盒应用q-PCR方法检测，即(1)将标本10 000 rpm室温离心5 min，弃去上清；(2)向上述管子中加入25 μl DNA提取试剂，混匀后，95 ℃加热10 min；10 000 rpm室温离心5 min后上清直接用于q-PCR检测HPV16、HPV18；(3)按照试剂盒要求采用ABI 7500检测；(4)结果判断。CT值<35的样本，即为高危型HPV阳性(高表达)；反之为高危型HPV阴性(低表达)。
2. 细胞培养：所有细胞系42℃复苏后，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。胰酶消化计数后，以2×104个/孔接种于96孔板中，加入10% FBS的DMEM高糖培养基培养24 h用于干预实验。
3. 转染实验：取miR-21抑制剂(inhibitor)和阴性对照类似物(negative control，NC)干粉，依照说明加入无菌TE溶液溶解至50 mM。取两支1.5 ml Ep管，各加入100 μl Opti-MEM后分别加入miR-21抑制剂(inhibitor)或NC和5 μl Lipo2000，混匀后室温孵育3 min，并将两者混合再室温孵育20 min，滴加入细胞中继续培养进行检测。
4. CCK-8实验：以终浓度为10 nM的miR-21抑制剂(inhibitor)和NC转染预先接种至96孔板培养24 h的H8、Hela、C4-I和Caski细胞2 h、24 h、48 h和72 h，加入CCK-8溶液后，37 ℃孵育1 h，采用酶标仪测定 450 nm 的吸光值(OD450)。每组设6个复孔，实验重复3次。
5.qRT-PCR实验：以含TRizol RNA 500 μl提取处理后的12孔板细胞，并使用NanoDrop2000对总RNA浓度和纯度进行检测。参照cDNA合成试剂盒操作步骤将500 ng总RNA逆转录为cDNA。取10 ng cDNA作模版，25 μl qRT-PCR反应体系，反应程序为95℃ 2 min、95℃ 5s、60℃ 30 s，扩增35个循环，引物序列见表1。以U6为内参，采用2△△Ct法计算miR-21相对表达量，以ACTB为内参计算CCND1、CCNE、CDK4、CDK6 mRNA的相对表达量。
6.Western blot实验：以含PMSF的RIPA裂解液100 μl裂解12孔板细胞。超声破碎后，4℃ 14 000 g离心20 min，上清以BCA法检测蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，95℃干热变性10 min。20 μg变性蛋白进行10% SDS-PAGE分离后，200 mA 2 h转移至0.45 μm的PVDF膜，2% BSA TBST溶液封闭30 min，孵育一抗(Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK6、和CYLD稀释比为1∶750；b-actin稀释比为1∶1 000)，4℃过夜，TBST漂洗3次，二抗(稀释比为1∶5 000)室温孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL显影。
表1 q-PCR引物序列及产物大小
Table 1 q-PCR primers sequence and product size
Gene namePrimer sequencesProduct size(bp)CCND1Forward5′-CAATGACCCCGCACGATTTC-3′146Reverse5′-CATGGAGGGCGGATTGGAA-3′CCNE1Forward5′-ACTCAACGTGCAAGCCTCG-3′141Reverse5′-GCTCAAGAAAGTGCTGATCCC-3′CDK4Forward5′-ATGGCTACCTCTCGATATGAGC-3′124Reverse5′-CATTGGGGACTCTCACACTCT-3′CDK6Forward5′-CCAGATGGCTCTAACCTCAGT-3′Reverse5′-AACTTCCACGAAAAAGAGGCTT-3′152CYLDForward5′-TTCACTGACGGGGTGTACCA-3′Reverse5′-CAGGACCTGCGTAATCACTTTC-3′133ACTBForward5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′Reverse5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′250
7.统计学处理：采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以
表示，两组比较采用Student′t检验，检验水平a为0.05(双尾)，P<0.05为差异有统计学意义。统计图均采用Graphpad Prism 7.0作图。
结 果
一、CC病人血浆中HPV16和HPV18、血浆和癌组织miR-21含量检测
如图1所示，CC患者血浆中HPV16和HPV18高表达(P<0.05)，其癌组织中miR-21含量显著高于癌旁组织(P<0.05)，且血浆中miR-21含量显著高于健康人(P<0.05)。
二、CC病人癌组织与血浆中miR-21与HPV16，HPV18和肿瘤尺寸相关性分析
检测CC患者血浆HPV16、HPV18水平和肿瘤尺寸并将其与CC组织和血浆miR-21含量作Pearson相关性分析发现，CC患者血浆HPV16、HPV18水平和肿瘤尺寸与血浆和癌组织miR-21含量成显著正相关性(P<0.001)。 见图2。
Notes:Compared with controls, *P<0.05
图1 CC病人癌组织与血浆中高表达HPV16，HPV18和miR-21
Figure 1 High expression of HPV16, HPV18 and miR-21 in cancer tissues and plasma of CC patients
Notes:***P<0.001
图2 CC病人癌组织与血浆中miR-21与HPV16, HPV18和肿瘤尺寸呈正相关
Figure 2 There is a positive correlation between miR-21, HPV16 and HPV18 in tumor tissue and plasma with tumor size in CC patients
三、人CC细胞系miR-21含量检测
检测多种CC细胞系的miR-21含量，发现人CC细胞系C4-I、C4-II、Hela、SiHa、C33A、Caski和MS751相比于正常细胞H8均高表达miR-21(P<0.05)，且通过miR-21抑制剂(inhibitor)处理，Hela细胞中miR-21含量显著降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)。见图3。
四、miR-21抑制剂(inhibitor)对正常和CC细胞生长影响
通过给予H8、Hela、C4-I、Caski细胞10 nM的miR-21抑制剂(inhibitor)处理2 h、24 h、48 h和72 h后，相比Control处理组，H8细胞miR-21水平均没有明显的变化(P>0.05)。而Hela、C4-I、Caski细胞细胞增殖率逐渐降低(P>0.05)，见图4。
五、下调miR-21对人CC Hela和Caski细胞周期相关蛋白表达的影响
为进一步探究下调miR-21对人CC Hela和Caski细胞增殖影响，检测细胞周期相关蛋白及其mRNA变化，结果如图5所示，人CC Hela和Caski细胞miR-21抑制剂组CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白和mRNA(CCND1、CCNE、CDK4)水平明显高于Control组(P<0.05)，Caski细胞miR-21抑制剂组CDK6蛋白和mRNA显著降低(P<0.05)，而Hela细胞miR-21抑制剂组的CDK6蛋白和mRNA无明显变化(P>0.05)。
六、下调miR-21对人CC Hela和Caski细胞CTLD蛋白表达的影响
为了研究miR-21对人CC Hela和Caski细胞周期调控的潜在机制，借助Western Blot检测Control和miR-21抑制剂转染处理24 h的人CC Hela和Caski细胞的CYLD蛋白和mRNA变化情况。miR-21抑制剂转染处理24 h的人CC Hela和Caski细胞中CYLD蛋白和mRNA水平均明显高于Control组(P<0.05)。见图6。
Notes:Compared with controls or H8, *P<0.05
图3 人CC细胞系高表达miR-21
Figure 3 miR-21 expression levels in human CC cell line
Notes:Compared with 2h, *P<0.05
图4 下调miR-21抑制人CC细胞系增殖
Figure 4 Down-regulation of miR-21 inhibits proliferation of human CC cell lines
Notes:Compared with control, *P<0.05
图5 下调miR-21抑制人CC细胞系细胞周期相关蛋白表达
Figure 5 Down-regulation of miR-21 inhibits cell-cycle-associated protein expression in human CC cell lines
Notes:Compared with control, *P<0.05
图6 下调miR-21促进人CC细胞系细胞CYLD蛋白表达
Figure 6 Down-regulation of miR-21 promotes CYLD protein expression in human CC cell lines
讨 论
除了寻找新的CC诊断标志物外，进一步了解CC发生的病理分子机制对于开发更有针对性和有效的治疗方法是至关重要的。近些年来，miRNA作为用于鉴别和诊断疾病的新发现，特别是作为慢性病和癌症的生物标记物(Biomarkers),其在神经科学和癌症发病机制研究中具有举足轻重的地位[7]。
CC的发病率在发展中国家几乎占了全球的80%，严重影响人类健康，给政府的卫生系统带来负担，迫切需要有效的治疗干预措施[2]。然而，由于CC发展的精细分子机制现在仍不清楚，其靶向治疗非常有限[1]。本研究CC患者外周血和癌组织高表达miR-21，其和升高的感染因子HPV16、HPV18含量及人体肿瘤体积呈现明显正相关性，说明miR-21可能成为与HPV16、HPV18相似的HCC诊断指标，可作为又一CC诊断与治疗评估指标，且参与CC发生发展，即肿瘤生长。并且发现其作为CC增殖的主要参与miRNA分子，高表达于多种公认的高度迁移、活化及增殖的CC细胞系；其次细胞转染实验，显示下调miR-21抑制多种CC细胞增殖，而不影响正常宫颈上皮细胞，说明其潜在的特异性。同时，文献报道称miR-21具有调控多种细胞增殖的潜能，包括影响细胞周期[9-11]。本研究发现，下调CC细胞高表达的miR-21可显著阻断CyclinD1-CDK4与CyclinE-CDK2复合物形成，抑制细胞周期，阻断G1向S期过渡[9]，同时证实此效应与上调肿瘤抑制分子CYLD有关[15]，为miR-21在CC研究及未来的临床应用提供又一有利支持。然而，由于miR-21在CC存在多态性，且作用于CCSTAT3和TIMP3多种分子[10, 16]，因此仍有待进一步研究。
综上所述，CC组织与癌细胞高表达的miR-21可能通过抑制CYLD蛋白介导癌细胞周期阻滞促进细胞增殖，同时，其可作为生物标记物参与CC的诊断和治疗监测。
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