早产是指妊娠满28周但不足37周的分娩。胎膜早破(premature rupture of membrane，PROM)是指临产前发生胎膜破裂，通常发生在孕37周后。如果PROM发生在孕28周至37周之间，则被定义为早产胎膜早破(preterm premature rupture of membrane，PPROM)。PPROM发生率约2%～4%[1]。人类基因中将近98%的DNA序列被发现能够转录成非编码RNA (noncoding RNA，ncRNA)[2]。近期的基因组研究表明，人类基因组能够转录和产生多种调节型ncRNA，其中长链非编码RNA (long noncoding RNA，lncRNA)在不同组别的胎盘组织中存在差异表达，并涉及多种生物学通路[3-4]。I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-like motifs, Adamts)家族成员可以调控胶原蛋白基质的降解过程，本研究将探讨该家族重要成员Adamts-9 lncRNA在PPROM中的调控作用，为今后探索胎膜早破及早产发病机制、预防早产提供临床科研信息。
对象与方法
一、对象
选取2017年3月至2018年3月在内蒙古自治区妇幼保健院产科分娩的孕妇，共120例。根据孕妇的分娩孕周以及胎膜早破情况，将孕妇分为：(1)早产胎膜早破组。年龄24～42岁，平均年龄(30.1±4.1)岁；孕周28～36周，平均孕周(34.0±2.4)周。(2)早产非胎膜早破组。年龄25～40岁，平均年龄(29.9±3.7)岁；孕周29～36周，平均孕周(34.0±2.5)周。(3)足月胎膜早破组。年龄24～35岁，平均年龄(29.4±3.1)岁；孕周37～41周，平均孕周(39.2±1.1)周。(4)足月非胎膜早破组。年龄24～41岁，平均年龄(30.4±3.9)岁；孕周38～41周，平均孕周(40.1±0.9)周。每组30例。早产以及胎膜早破的诊断参照第八版妇产科学的诊断标准[5]，即早产为妊娠满28周但不足37周之间分娩；胎膜早破即在临产前出现胎膜自然破裂。所有标本均在胎盘胎膜娩出后5 min内进行采集，沿胎膜破口边缘一周，剪下距离破口边缘宽度为2 cm的胎膜组织，然后分剪成6块2 cm×2 cm的胎膜组织，分别装入标本袋中，将分组，姓名，年龄，住院号等基本信息进行标记。标本采集后15 min内放入-80 ℃冰箱冻存待用。研究前，由医师与孕妇或其家属签署知情同意书，记录孕妇的基本临床信息。所选孕妇均为自然受孕且经阴道自然分娩，除外剖宫产手术分娩者。
二、方法
1.样本RNA提取(Trizol法)：取50～100 mg胎膜组织，加入1 000 μl Trizol，冰上匀浆，震荡混匀，室温放置5 min。加入200 μl氯仿震荡混匀10 s，室温放置3 min，待溶液分层后，4 ℃、12 000 rpm 离心15 min。吸水相(上清)到尖底离心管(RNase-Free)中，各加入400 μl 异丙醇(RNA沉淀)，缓慢颠倒混匀，-20 ℃放置30～60 min。取出4℃、12 000 rpm离心15 min。RNA沉于离心管底部，弃上清，加入1 ml 75%乙醇(RNase-Free超纯水配制)，轻轻吹打洗涤沉淀，4℃、12 000 rpm 离心10 min。弃上清，室温干燥5～10 min(去除乙醇)，加入15～20 μl RNase-Free H2O溶解RNA。
2. RNA质检：(1)微量分光光度计检测浓度及纯度。滴加2 μl待测RNA样品至检测台进行检测，读值。(2)琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。①制胶；②电泳，取1.5 μl RNA样本上样电泳；③观察紫外透射光下观察并拍照。合格情况可见28S和18S核糖体RNA的条带亮而浓。
3.反转录：(1)反转录体系。包括Random Primer1μl、Total RNA1μg、5× 酶缓冲液 4 μl、dNTP mix 2 μl Protector RNase Inhibitor 1 μl 和Transcriptase 1 μl，最终用RNase-free ddH2O 补足到20 μl。(2)反转录程序。25 ℃，5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃，5 min；所得cDNA低温保存。
4.荧光定量PCR：(1)引物。①设计内参基因B2M上下游特异引物。B2M-F 5′ CTCTTTCTGGCC TGGAGGCTAT 3′, B2M-R 5′ AGTCAACTTCAATG TCGG- ATGGAT 3′, 退火温度设为60 ℃，产物长度为135 bp；②设计lncAdamts-9上下游特异引物。Lnc-ADAM9-F 5′ TACATACAATGGTCAGATGGCAAA 3′, Lnc-ADAM9-R 5′ GCCTTGATGGGAACTGCTGA 3′, 退火温度设为60 ℃，产物长度为169 bp；③设计Adamts-9 cDNA上下游引物。ADAM9-F 5′ GCCAC-TGGGAATGCTTTGT 3′，ADAM9-R 5′ GCA GTATTCATTTCATTGT- ATGTAGGT 3′, 退火温度为60 ℃，产物大小为392 bp。
(2)Real-time PCR。①PCR反应体系与加样。2 × Master Mix(Roche)5.0 μl、PCR特异引物(10 μM)0.6 μl和1μl cDNA，最终加ddH2O至总体积为10 μl，将混合液加到384-PCR板对应的孔中。小心粘上Real-time PCR 专用封口膜，并短暂离心混合。在设置Real-time PCR程序前将准备好的384-PCR板放在冰上。②扩增程序(ABI Quant Studio 6 Flex)。扩增程序设为95 ℃ 10 min、95℃ 15 s、45cycle 60 ℃ 60 s(收集荧光)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，程序分别设为(95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15s，并从60 ℃缓慢加热到99 ℃(+0.05℃/s，期间收集荧光)。
5.结果与计算：样品的目的基因和内参基因分别进行Real-time PCR反应。采用ΔΔCт的相对定量：各样品目的基因和内参基因的Cт值直接由仪器生成。每个样品的目的基因浓度除以其内参基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。
6.统计学处理：应用SPSS 13.0统计软件，运行独立样本t检验，取P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、Adamts-9的相对定量结果及统计分析
Adamts-9表达量在早产胎膜早破组(PD & PRM，RQ=1.093)显著高于早产无胎膜早破组(PD & non-PRM，RQ=0.722；P=0.025)，早产无胎膜早破组(PD & non-PRM，RQ=0.722)要显著低于足月胎膜早破组(FTD & PRM， RQ=1.381；P=0.009)。此外，在胎膜早破组(早产胎膜早破组+足月胎膜早破组=PD & PRM and PTD & PRM，RQ=1.237)要高于非胎膜早破组(早产无胎膜早破组+足月无胎膜早破组= PD & non-PRM and PTD & non-PRM，RQ=0.876；P=0.02)。见表1。
二、LncAdamts-9的相对定量结果及统计分析
IncAdamts-9在早产胎膜早破组(PD & PRM，RQ=1.096)中含量显著高于早产无胎膜早破组(PD & non-PRM，RQ=0.710；P=0.025)，早产胎膜早破组(PD & PRM，RQ=1.096)显著低于足月胎膜早破(FTD &PRM, RQ=1.602；P=0.011)，早产无胎膜早破组(PD & non-PRM，RQ=0.710)显著低于足月胎膜早破(FTD &PRM, RQ=1.602；P<0.001)，早产组(早产胎膜早破组+早产无胎膜早破组=PD & PRM and PD & non-PRM，RQ=0.903)含量要显著低于足月组(足月无胎膜早破组+足月胎膜早破组= FTD & non-PRM and FTD &PRM，RQ=1.263；P=0.005) ，胎膜早破组(早产胎膜早破组+足月胎膜早破组= PD & PRM and FTD & PRM，RQ=1.349)要显著高于非胎膜早破组(早产无胎膜早破组+足月无胎膜早破组= FTD & non-PRM and PD & non-PRM，RQ=0.817；P<0.001) 。见表2。
表1 Adamts-9在4个组胎膜样本中的相对定量结果
Table 1 Relative quantifications of Adamts-9 in four groups of fetal membrane samples
GroupsRQ mean valuesPvaluesvs PD & PRMvs FTD & non-PRMvs PD & non-PRMvs FTD & PRMvs FTD & non-PRM and PD & non-PRM PD & PRM1.093-0.7390.0250.241-PD & non-PRM0.722---0.009-FTD & non-PRM1.029--0.1190.191-FTD & PRM1.381-----PD & PRM and PTD & PRM1.237----0.02FTD & non-PRM and PD & non-PRM0.876-----
Abbreviation: PD=Premature Delivery; PRM=Premature Rupture of Membrane; non-PRM=non-Premature Rupture of Membrane; FTD=Full-Term Delivery
表2 lncAdamts-9在4个组胎膜样本中的相对定量结果
Table 2 Relative quantifications of lncAdamts-9 in four groups of fetal membrane samples
GroupsRQ meanvaluesPvaluesvs PD &PRM vs FTD &non-PRM vs PD &non-PRM vs FTD &PRM vs FTD & non-PRMand PD & non-PRM vs FTD & non-PRMand FTD & PRM PD & PRM1.096-0.3070.0250.011--PD & non-PRM0.710---<0.001--FTD & PRM1.602------FTD & non-PRM0.924--0.099<0.001--PD & PRM and PD & non-PRM0.903-----0.005FTD & non-PRM and FTD &PRM1.263------PD & PRM and FTD & PRM 1.349----<0.001-FTD & non-PRM and PD & non-PRM 0.817------
Abbreviation: PD=Premature Delivery; PRM=Premature Rupture of Membrane; non-PRM=non-Premature Rupture of Membrane; FTD=Full-Term Delivery
讨 论
一、lncAdamts-9 可能不直接参与早产发生
lncRNA一般指长度大于200 bp的ncRNA，通常与编码蛋白的RNA分子以及蛋白分子共同组成复合物。研究显示，越来越多lncRNA被发现在多种生物学过程调节中发挥重要作用，这些过程涉及剪接、转录、定位以及亚细胞区域的组成[6]。目前，许多疾病的病因学研究均强调lncRNA调节作用的重要性，尤其是在那些有遗传和环境因素共同作用的复杂性疾病中[7]。现有研究表明，PPROM存在遗传易感性[8]，但基因组相关的研究至今没有鉴别出引起PPROM的基因。PPROM属复杂性疾病，涉及基因与环境的相互作用。环境因素已被证明是导致PPROM的重要病因，虽然环境因素不能改变基因的结构，但能够引起表观遗传学调控的改变，进而影响基因的表达。本研究对Adamts-9 基因lncRNA进行相对定量检测，在早产和足月产、胎膜早破和非胎膜早破样本进行差异化分析，并对样本进行了分组(A：早产胎膜早破组，B：足月无胎膜早破组，C：早产无胎膜早破组，D：足月胎膜早破组)，结果发现，足月组(BD)中lncAdamts-9 要高于早产组(AC组)，组间差异有统计学意义，说明lncAdamts-9可能参与了妊娠结局的调控。但是，lncAdamts-9可能不直接和早产相关联，在4个组中，其在早产无胎膜早破组中水平是最低的，要低于早产胎膜早破组。
二、Adamts基因家族很可能调节胎膜中胶原蛋白含量变化
ADAMTS基因家族属于细胞外的多结构蛋白酶，根据序列比对结果和蛋白酶的功能不同分为四亚类，即第一亚类降解底物为聚蛋白聚糖，第二亚类降解底物包括I型、II型和III型原骨胶原的肽段[9-11]，第三亚类是血管性血友病因子(von willebrand factor, vWF)的降解蛋白酶，第四亚类为蛋白结构特征相似的蛋白酶。Adamts-8 和Adamts-9基因属于第一类。研究发现，病毒感染小鼠的胎膜和胎盘中Adamts编码基因相关lncRNA(lncAdamts-8、lncAdamts-13和lncAdamts-14)的差异表达提示，lncRNA在小鼠胎盘和胎膜组织中可能参与了这些Adamts基因的转录水平和转录后水平的调节[4]。这些由病毒感染引起的差异表达的lncAdamts可以调控Adamts基因的表达，ADAMTS蛋白含量的改变最终导致早产或胎膜破裂相关高危因素的发生，这些高危因素主要包括胎膜中胶原蛋白和细胞外基质的改变，血管生成异常以及凝血等。本研究结果证明这种推测，在胎膜早破组中(AD)，Adamts-9基因表达量要大于非胎膜早破组(BC)，说明机体在其他因素诱导胎膜早破时，提高了Adamts-9基因表达来抵抗PROM的发生。
三、总结
本研究通过对不同组别(早产、足月、胎膜早破)孕妇胎膜样本中分析Adamts-9和lncAdamts-9相对含量，探讨lncAdamts-9对PROM是否关联。本研究结果发现，PROM胎膜组织中Adamts-9及lncAdamts-9相比对照组表达量显著变化，Adamts-9及lncAdamts-9可能参与PROM的逆向调控。
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