反复喘息属于呼吸道疾病之一，婴幼儿反复喘息发生率较高，同时反复喘息还可增加呼吸道高反应性及哮喘的发生风险[1]。研究显示，采用肺功能检测诊断反复喘息婴幼儿具有重要参考价值，其中潮气呼吸肺功能检测指标均对反复喘息婴幼儿具有较高诊断价值[2]。由于反复喘息严重影响患儿生长发育及身心健康发展，因而分析喘息相关影响因素及其可能机制对降低婴幼儿哮喘发生及提高治疗效果均具有重要意义。研究表明，辅助性T淋巴细胞1(T helper cell 1，Th1)与辅助性T淋巴细胞2(T helper cell 2，Th2)比例失衡常可参与哮喘发生及发展过程[3]。研究显示，γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)与白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)是Th1细胞分泌的主要细胞因子，而白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)是Th2细胞分泌的主要细胞因子，IFN-γ/IL-4比值可反应Th1/Th2比值状态[4]。辅助性T淋巴细胞(T helper cell，Th)定向分化取决于其转录因子的表达，相关研究表明T-bet(T-box expressed in T cells)可控制Th细胞分化为Th1，而GATA结合蛋白3(GATA-binding protein-3，GATA-3)可控制Th细胞分化为Th2[5]。关于反复喘息婴幼儿的T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2平衡的相关性研究相对较少，因此，本研究主要探讨T-bet/GATA-3比值与反复喘息婴幼儿潮气呼吸肺功能及其与Th1/Th2平衡的关系，旨在为临床诊断及治疗提供参考依据。
资料与方法
1.一般资料：选取2017年12月至2018年5月本院收治的反复喘息婴幼儿86例为反复喘息组，判断标准均参照相关文献[6]，其中男52例，女34例，年龄为6～36个月，平均年龄为(23.6±6.2)个月。根据反复喘息婴幼儿肺功能分度[7]将其分为轻度阻塞组(30例)、中度阻塞组(42例)、重度阻塞组(14例)。同时选取同期在本院儿保门诊体检的健康儿童72例为对照组，其中男37例，女35例，年龄为10～36个月，平均为(22.1±6.4)个月。两组儿童性别、年龄、营养状况等临床资料比较，差异无统计学意义，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有婴幼儿家长均知情同意。
纳入标准包括(1)反复喘息婴幼儿表现为反复咳嗽且肺部有鸣音；(2)未曾服用免疫抑制剂及免疫调节剂。排除标准包括(1)患有先天性心脏病；(2)支气管及肺发育不良患儿；(3)支气管异物等其他原因引起的喘息；(4)先天性气道发育畸形引起的喘息。
2.样本采集与分离：分别抽取两组受试幼儿外周静脉血5 ml，置于EDTA抗凝试管内，加入磷酸盐缓冲液稀释，参照相关文献提取单个核细胞[8]，并将其置于含有双抗(1%)与含有胎牛血清的RPMI 1640培养液中待用。
3.实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测T-bet、GATA-3 mRNA表达水平：取单核细胞(1×106)并采用TRNzol Universal总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取细胞总RNA，紫外分光光度计(北京京科瑞达科技有限公司)检测RNA纯度及浓度。根据QuantScript RT Kit试剂盒(北京天根生化科技有限公司)将RNA反转录为cDNA。T-bet上游引物序列为5′-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3′，下游引物序列为5′-CCCGGCCACAGTAAATGACAGG-3′；GATA-3上游引物序列为5′-CCTCATTAA GCCCAAGCGAAG-3′，下游引物序列为5′-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3′；β-actin正向引物序列为5′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，反向引物序列为5′-AGGTCCAG ACGCAGGATGGCATG-3′，引物均由北京博尔迈生物技术公司。按照SYBR© Green JumpStart Taq ReadyMix 试剂盒(美国Sigma公司)说明书进行qRT-PCR反应。置于LightCycler96荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)进行扩增反应，程序设定为95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt相对定量法计算T-bet、GATA-3 mRNA的相对表达量。
4.流式细胞仪检测Th1/Th2细胞百分率：分别取单核细胞(1×106)置于细胞培养液(1ml)内，加入PMA、Ionomycin溶液(终浓度分别为0.1 mg/ml、1mg/ml)及2 μl Golgistop溶液，其中PMA与Ionomycin均购自美国Sigma公司，Golgistop购自美国BD公司。置于培养箱内培养6 h，收集细胞并采用磷酸盐缓冲液清洗，取3个流式管分别加入CD3-eFluor(5 μl)、CD8a-FITC抗体(5 μl)，室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液清洗后加入200 μl破膜剂(美国BD公司)，同时分别向2个流式管内加入IFN-γ-PE(5 μl)、抗IL-4-PE(5 μl)，对照管内加入同型对照抗体，室温孵育30 min，清洗后加150 μl多聚甲醛固定液重悬细胞，置于BD FACS CantoTMⅡ型流式细胞仪(北京东迅天地医疗仪器有限公司)进行检测，Th1细胞中检测IFN-γ表达情况，Th2细胞中检测IL-4表达情况。
5.检测Th1/Th2细胞因子水平：取两组儿童静脉血4 ml，经3 500 r/min转速离心机离心5 min分离血清，采用酶联免疫吸附法检测血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平，检测试剂盒均购自美国Ebioscience公司，Synergy NEO2 HTS全功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。
6.潮气呼吸肺功能检测：采用Master Screen Paed型儿童肺功能仪(德国耶格公司)检测两组受试儿童潮气呼吸肺功能，需先清理患儿鼻咽与呼吸道分泌物，待两组受试儿童熟睡后取仰卧位，择取适合面罩置于口鼻，潮气呼吸肺功能主要参数包括每千克体重潮气量(tidal volume per kilogram of body weight，VT/kg)、吸呼比(inhalation time / expiration time，Ti/Te)、达峰时间比(time to peak expiratory flow / time to expiratory，TPTEF/TE)、达峰容积比(volume to peak expiratory flow / volume to expiratory，VPEF/VE)、呼吸频率(respiratory rate，RR)、潮气呼吸呼气峰流速(peak tidal expiratory flow rate，PTEF)。根据TPTEF/TE与VPEF/VE比值范围将反复喘息婴幼儿分为肺功能轻度阻塞组、中度阻塞组与重度阻塞组，分析反复喘息婴幼儿不同肺功能组T-bet/GATA-3比值变化。
7.统计学处理：采用统计学软件SPSS17.0对数据进行分析，计量资料符合正态分布的数据均以
表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用[例(%)]表示，采用χ2检验；Pearson法分析各参数间的相关性，各组数据均以P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.两组研究对象T-bet/GATA-3比值比较：反复喘息组患儿T-bet mRNA表达水平与T-bet/GATA-3比值均显著低于对照组(P<0.05)，而GATA-3 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见表1。
2.两组儿童潮气呼吸肺功能参数比较：反复喘息组患儿VT、Ti/Te、TPTEF/TE、VPEF/VE均显著低于对照组(P<0.05)，而RR、PTEF均显著高于对照组(P<0.05)，见表2。
表1 两组研究对象T-bet/GATA-3比值比较
组别 例数T-bet/β-actinGATA-3/β-actinT-bet/GATA-3反复喘息组860.71±0.21∗2.12±0.56∗0.51±0.11∗对照组 721.04±0.181.03±0.121.02±0.15
注：与对照组比较，*P<0.05
3.反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3比值与潮气呼吸肺功能的关系：结果显示，重度阻塞组与中度阻塞组T-bet mRNA表达水平与T-bet/GATA-3比值均显著低于轻度阻塞组(P<0.05)，且重度阻塞组显著低于中度阻塞组(P<0.05)；而GATA-3 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，且重度阻塞组显著高于中度阻塞组(P<0.05)，见表3。
采用Pearson法进一步分析反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3比值与潮气呼吸肺功能参数的相关性，结果显示，T-bet/GATA-3比值与VT、Ti/Te呈显著正相关关系(P<0.05)，而与RR呈负相关(P<0.05)，但与PTEF无明显相关性(P>0.05)，见表4。
表2 两组儿童潮气呼吸肺功能参数比较
组别 例数VT(ml/kg)RR(次/分)Ti/TeTPTEF/TE(%)VPEF/VE(%)PTEF(ml/s)反复喘息组866.84±2.28∗34.78±10.59∗0.64±0.21∗24.48±7.16∗26.65±8.78∗155.45±21.82∗对照组 727.62±2.5428.51±9.35 0.82±0.2730.36±9.1236.25±10.08148.41±19.47
注：与对照组比较，*P<0.05
表3 反复喘息婴幼儿不同肺功能分度与T-bet/GATA-3比值的关系
组别 例数T-bet/β-actinGATA-3/β-actinT-bet/GATA-3轻度阻塞300.80±0.231.41±0.450.65±0.22中度阻塞420.65±0.18∗1.76±0.58∗0.42±0.11∗重度阻塞140.54±0.12∗#2.20±0.73∗#0.31±0.09∗#
注：与轻度阻塞组比较，*P <0.05；与中度阻塞组比较，#P <0.05
表4 反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3比值与
潮气呼吸肺功能参数的相关性分析
参数T-bet/GATA-3比值rPVT0.3260.002RR-0.3070.004Ti/Te0.2630.014PTEF-0.1050.336
4.两组受试儿童Th1/Th2细胞百分率及其细胞因子比较：反复喘息组患儿Th1与Th1/Th2细胞百分率均显著低于对照组(P<0.05)，而Th2细胞百分率显著高于对照组(P<0.05)，见表5。
研究患儿血清IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均显著低于对照组(P<0.05)，而血清IL-4、IL-10水平均显著高于对照组(P<0.05)，见表6。
5.反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2平衡的关系：采用Pearson法分析反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2细胞比值的相关性，结果显示，T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2呈正相关(r=0.307，P=0.004)，见图1。
表5 两组受试儿童Th1/Th2细胞百分率比较
组别 例数Th1(%)Th2(%)Th1/Th2反复喘息组8616.82±5.61∗1.12±0.37∗15.67±5.23∗对照组 7223.24±7.740.75±0.2531.26±10.12
注：与对照组比较，*P<0.05
表6 两组儿童Th1/Th2细胞因子比较
组别 例数IFN-γ(ng/L)IL-4(ng/L)IL-10(ng/L)IFN-γ/IL-4反复喘息组8631.37±9.75∗25.47±8.49∗9.21±3.07∗1.32±0.45∗对照组 7236.85±10.288.65±2.894.38±1.454.21±1.41
注：与对照组比较，*P<0.05
图1 反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2的相关性分析
讨论
喘息是婴幼儿常见呼吸系统疾病之一，而反复喘息可导致哮喘的发生，其主要病理特征为气流受限与气道高反应性，婴幼儿反复喘息与哮喘的诊断及治疗是研究难题[9]。肺功能检测可作为反复喘息及哮喘的辅助诊断，也可作为评估疾病严重程度及治疗效果的依据[10]。因此，探究婴幼儿反复喘息的可能发病机理并及时采取干预措施对提高治疗效果及改善患儿预后均具有重要意义。
转录因子T-bet在哮喘患者肺组织中呈低表达并减少IFN-γ分泌，而转录因子GATA-3在哮喘患者肺泡灌洗液及支气管粘膜活检组织中呈高表达，其表达水平与患者气道高反应性呈正相关，而与气道口径呈负相关[11-12]。研究表明，哮喘儿童外周血单核细胞中T-bet表达水平低于正常儿童，而GATA-3表达水平高于正常儿童，T-bet/GATA-3比值失衡与儿童哮喘发生及发展密切相关[13]。关于反复喘息婴幼儿中T-bet/GATA-3比值表达变化的研究相对较少，本研究结果显示，反复喘息婴幼儿外周血单核细胞中T-bet表达水平与T-bet/GATA-3比值均低于正常儿童，而GATA-3表达水平明显升高，说明T-bet与GATA-3均参与婴幼儿反复喘息过程，T-bet/GATA-3比值降低可能导致婴幼儿反复喘息的发生。提示婴幼儿外周血单核细胞中T-bet/GATA-3失衡可作为判断婴幼儿反复喘息发生的重要辅助指标。潮气呼吸肺功能检测是用于评估婴幼儿肺功能的技术，研究显示，TPTEF/TE与VPEF/VE是潮气呼吸肺功能检测的重要参数，并可用于评估患儿小气道阻塞情况，其数值越低提示小气道阻塞越严重[14]。本研究结果显示，反复喘息患儿VT、Ti/Te、TPTEF/TE、VPEF/VE均低于对照组，而RR、PTEF均明显升高，VT降低与RR升高可能是由于气道炎性反应发生增加分泌物生成量并引起下呼吸道阻塞导致肺部通气及换气功能障碍，Ti/Te降低说明反复喘息患儿气道阻塞时呼气时间过长，TPTEF/TE与VPEF/VE降低说明反复喘息患儿存在阻塞性通气功能障碍且与阻塞严重程度有关，PTEF升高说明反复喘息患儿大气道阻力增强。进一步分析T-bet/GATA-3比值与反复喘息患儿潮气呼吸肺功能的关系，本研究根据患儿肺功能将其分为轻度阻塞组、中度阻塞组与重度阻塞组，结果显示，重度阻塞组与中度阻塞组T-bet表达水平与T-bet/GATA-3比值均低于轻度阻塞组，且重度阻塞组低于中度阻塞组；而GATA-3表达水平升高，且重度阻塞组高于中度阻塞组，说明随着反复喘息患儿肺功能减弱T-bet/GATA-3比值明显降低。相关性分析显示，T-bet/GATA-3比值与VT、Ti/Te呈正相关，而与RR呈负相关，提示T-bet/GATA-3比值与反复喘息患儿潮气呼吸肺功能密切相关。
T-bet可促进Th细胞分化为Th1细胞，并激活IFN-γ基因表达进而提高其表达水平，同时抑制Th2细胞生成并可将其转化为Th1细胞[15]。GATA-3可促进Th细胞转化为Th2细胞并促使Th2细胞因子IL-4生成，同时可抑制Th1细胞生成并促进Th2细胞生成，研究显示，哮喘患儿T-bet/GATA-3比值可作为衡量Th1/Th2细胞平衡的重要指标[16]。Th1细胞的主要细胞因子IFN-γ可激活巨噬细胞并促使其分泌细胞因子进而发挥抗炎、抗感染免疫等作用，研究表明Th2细胞分泌的IL-4可促使IFN-γ分泌减少并刺激B淋巴细胞产生炎性细胞因子进而促进哮喘等炎症性疾病发生[17]。关于Th1/Th2失衡与反复喘息婴幼儿之间关系的研究相对较少，本研究结果显示，反复喘息患儿Th1、Th1/Th2细胞百分率、血清IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均显著低于对照组，而Th2细胞百分率、血清IL-4、IL-10水平均显著高于对照组，说明Th1/Th2失衡可促进炎性因子IL-4、IL-10释放进而加重患儿体内炎症反应，提示Th1/Th2失衡与婴幼儿反复喘息发生有关。进一步分析发现T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2细胞百分率呈正相关，提示T-bet/GATA-3比值降低促进Th1/Th2失衡进而导致反复喘息婴幼儿免疫失衡。
综上所述，反复喘息婴幼儿外周血单核细胞中T-bet/GATA-3比值降低，并与患儿潮气呼吸肺功能有关，同时还可导致患儿免疫失衡，有效逆转T-bet/GATA-3比值可能作为反复喘息婴幼儿的治疗切入点。本研究存在一定不足，关于T-bet与GATA-3在婴幼儿反复喘息发生及发展过程的具体作用机制有待深入研究。
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